penicillium.spts67抗植物病原真菌活性蛋白質的分離與鑒定

1、分類號 密級天津商業(yè)大學碩士研究生畢業(yè)( 學位) 論文姓 名：張志娟年 級：2 0 0 7 級．專 業(yè)：發(fā)酵工程研究方向：微生物資源開發(fā)與利用論文題目：P e n i c j _ - j 拋s pT S 6 7 抗植物病原真菌活性 渺蛋卣的分離與鑒定導 師：王素英教授完成日期：2 0 1 0 年5 月1 日天津商業(yè)大學摘要以從渤海近海域分離獲得能夠抑制多種植物病原真菌的P e n i c i l l u m s p ．T S 6 7 菌

2、株為實驗竹料，對其胞外抑菌活性蛋白的分離純化方法、不I 亓J 方法的L 豈條件進行了優(yōu)化，同時x f S H 蚩白的生物i I t 性進行了研究，為該蛋白質結構的確定和功能的進一步升發(fā)奠定基礎。論文首先在P e n i c i l l u ms p ．T S 6 7 抑菌活性測定的基礎上，選用硫酸銨鹽析法、聚乙二醇成析法、低溫乙醇沉淀法和雙水相萃取法從原發(fā)酵液中初步濃縮活性蛋白質，進行了各種方法的條件摸索和比較，發(fā)現(xiàn)硫酸銨鹽析法獲得的活

3、性蛋白質量和抑菌圈直徑明顯高于其他方法?；钚缘鞍踪|的提取率( 沉淀的蛋白量／發(fā)酵液的蛋白量) 為3 0 ％，抑菌圈直徑為1 ．9 5 c m 。其次對初步濃縮獲得的粗蛋白采用了三種方法脫鹽，即S e p h a d e x G 一2 5 柱脫鹽，超濾脫鹽和透析袋脫鹽。以蛋白的活性大小和抑菌圈直徑的大小及脫鹽時問的長短為原則，S e p h a d e x G ．2 5 柱脫鹽稍優(yōu)于透析袋脫鹽，超濾脫鹽則由于導致活性大大減小而最差。用S

4、e p h a d e x G ．2 5 柱脫鹽后，雖然本實驗用的截留分子量為8 0 K D 超濾膜截留住了活性蛋白質，但是抑菌圈直徑也只有0 ．9 厘米。而S e p h a d e x G ．7 5 柱分離時只出現(xiàn)了一個峰，沒有任何分離效果。S e p h a d e x G 一1 0 0 柱分離洗脫出兩個蛋白峰，其中只有第一個蛋白峰對植物病原真菌病有拮抗作用。在D E A E —s e p h a d e x - h 5 0 陰離

5、子交換柱進行層析分離時，獲得四個峰，其中第一個峰是活性蛋白峰。經S D S - P A G E 電泳鑒定后為電泳純，分子量約為8 3 K D ．電泳純的抑菌活性茚三酮反應為陽性，苯酚一硫酸法后沒有橙黃色出現(xiàn)，且糖蛋白電泳染色法的電泳膠上沒有紫紅色條帶出現(xiàn)。幾丁質測定該活性蛋白質，沒有發(fā)現(xiàn)其有活性。而用1 3 一葡聚糖做底物，反應產物與D N S 試劑顯色。取硫酸鋅和野尻霉素作為1 3 一葡聚糖酶的抑制劑做牛津杯實驗時，發(fā)現(xiàn)隨著抑制劑量的