匍匐翦股穎離體再生體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化研究;匍匐翦股穎na39;h39;反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆

1、分類(lèi)號(hào)：一 密級(jí)：，單位代碼：一10 6 9 1學(xué) 號(hào)： ! Q Q ! ! 1 9 1 1西北大學(xué)碩士學(xué)位論文題目：囪塑蔓壁題塞簽?zāi)久僳栈属~(yú)逮堡掛垡塑塞；一囪塑蔓照塑盟壘：』旦：區(qū)魚(yú)掛重量魚(yú)叁固煎盤(pán)隆作者：皇j 整一指導(dǎo)教師： 盆至塑 專(zhuān)業(yè)技術(shù)職務(wù)： 塑撞學(xué)科( 專(zhuān)業(yè)) ：—— 紐照生塹堂答辯日期： ! ! ! ! 生i 旦 學(xué)位授予日期：二零零七年性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生研究，旨在為進(jìn)一步利用現(xiàn)代遺傳工程技術(shù)改良

2、匍匐翦股穎品質(zhì)、培育新品種提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究利用成熟種子作為外植體，分析了2 ，4 D 對(duì)匍匐翦股穎胚性愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的影響，并對(duì)體細(xì)胞胚的發(fā)生過(guò)程進(jìn)行了觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，附加2 ．0 l n g ／L 2 , 4 - D 、0 ．1 t o g a _ , 6 - B A 時(shí)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)頻率最高。隨著2 ，4 - D濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)和分化能力明顯下降。在再生過(guò)程中采用1 ．0m g ／L的6 ．B A i

3、大至0 了比較好的效果，大部分實(shí)驗(yàn)中愈傷組織的再生頻率達(dá)到9 0 ％以上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高肌醇濃度可以使苗長(zhǎng)得較為粗壯。在實(shí)驗(yàn)中還對(duì)匍匐翦股穎的體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎的體細(xì)胞胚發(fā)生要經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉胚等不同階段。分別以0 ．6 t o o 帆和0 ．4 m o l ／L l 時(shí)露醇高滲處理5 , b 時(shí)和1 2 個(gè)小時(shí)的匍匐翦股穎胚性愈傷組織為目標(biāo)材料，利用P D S l 0 0 0 ／H e 基因槍

4、和根癌農(nóng)桿菌( A g r o b a c t e r i u mr u m P 勵(lì)c i e n s ) L B A 4 4 0 4 菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，目的基因?yàn)镹 棚+ 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因A t N H X l 。所用質(zhì)粒p H Z X l F h p B l l 2 1 改造而來(lái)，克隆有擬南芥N a Ⅵr 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基[ 1 I A t N H X l 和選擇標(biāo)記基因n p t I I ，上游為C a M V 3 5 S 啟動(dòng)子，

5、下游為N O S 終止子。將轉(zhuǎn)化過(guò)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至附加1 0 0 m g 脯酸卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，分別獲得6 株( 基因槍法) 和3 株( 農(nóng)桿菌法) 綠茁。對(duì)獲得的綠苗進(jìn)行P C R檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分別有一株( 基因槍法) 和兩株( 農(nóng)桿菌法) 綠苗可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，初步鑒定為轉(zhuǎn)基因植株。2 ．N a + ／H + 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列的克隆與分析N a + m + 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與植物的耐鹽性有密切的關(guān)系。在高等植物體內(nèi)，液泡膜

6、N a + ／H + 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要負(fù)責(zé)把N a + 區(qū)隔化至液泡中。植物的N a Ⅶ+ 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有很高的保守性，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的液泡膜N a Ⅶ+ 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，可以從其它物種中分離同源基因。本工作首先提取翦股穎總R N A 并反轉(zhuǎn)錄合成e D N A 第一鏈，然后采用簡(jiǎn)并引物通過(guò)梯度P C R技術(shù)擴(kuò)增出匍匐翦股穎液泡膜N a 佃+ 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白e D N A 的中間序列，大小約3 0 0 b p