基于新月柄桿菌rsaa分泌機制的高效通用胞外分泌表達系統(tǒng)pqabpse.colim15的構(gòu)建及應用研究

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文基于新月柄桿菌RsaA分泌機制的高效通用胞外分泌表達系統(tǒng)pQABPS/E.coli M15的構(gòu)建及應用研究姓名：寧亞蕾申請學位級別：博士專業(yè)：臨床檢驗診斷學指導教師：鄒全明20090501第三軍醫(yī)大學博七學位論文統(tǒng)進行優(yōu)化。本課題完成了以下幾個方面的工作：1 ．外源基因表達調(diào)控序列的篩選。首先克隆了六個基因表達調(diào)控序列M B 丌( 核糖體終止子) 、強組成型T 5 啟動子P T s 及其突變體P 下w 、中等強度

2、組成型p 一內(nèi)酰胺酶啟動子P B 及包含其本身s D 序列的P B S ，以及翻譯增強序列E p s i l o n ( T 7 噬菌體g e n e —1 0 翻譯增強子序列) 及S D 序列( 簡寫為E S D ) 。然后觀察在不同的宿主菌E ∞以J M l 0 9 和E ∞廳M 1 5 中，不同的調(diào)控序列組合調(diào)控報告基因G F P 的表達情況，結(jié)果表明，廠M B 丌．P T s —E s D 和，．m B “ 一P B —E S

3、D 兩個組合效果較好。隨后驗證了它們對R s a A 系統(tǒng)各單個分泌功能基因坶口D 、坶口E 、瑙口砌和廠J 以乃的表達調(diào)控作用，結(jié)果表明它們起到了預期的作用，可以用于下一步的載體構(gòu)建。2 ．胞外分泌表達載體p Q A B P S 的構(gòu)建及鑒定1 ) 克隆了四個5 ’端帶E S D 序列的R s a A 分泌功能基因坩口D 、船口E 、坶口凡和坶口乃，利用同尾酶將它們連接起來，得到E S D D E F a b 片段，與第一部分篩選出的

4、外源調(diào)控序列組合冊B 丌．P T s ／珊j 5 f 刀．P T B 及R s a A 分泌系統(tǒng)C 端信號序列坶以s 一起克隆至p Q E 3 0骨架載體，得到本課題的目的載體p Q A B P S 。2 ) 用該載體表達報告分子G F P ，結(jié)果表明G F P 能夠被分泌至胞外培養(yǎng)基中，分泌量為1 ．O m g ／L ；同時在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平面檢測到了分泌功能蛋白的組成型表達，結(jié)合W e s t e mb l o t t i n g

5、 結(jié)果，證明G F P 的胞外運輸是通過特異的R s a A 轉(zhuǎn)運裝置而非滲漏表達。3 ) 質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示，在有選擇壓力存在的情況下，p Q A B P S 質(zhì)粒在M 1 5中能夠穩(wěn)定存在6 0 代，6 0 代之后丟失率稍增加，總體來說穩(wěn)定性良好。3 ．胞外分泌表達載體p Q A B P s 的優(yōu)化及應用初探1 ) 克隆了三個大小、來源不同的外源蛋白E s p A 、U r e B 和h I L ．2 4 驗證p Q A B P

6、 S ／M 1 5表達系統(tǒng)的通用性，結(jié)果表明，它們均被成功分泌至胞外培養(yǎng)基中。2 ) 用E L I S A 試劑盒定量檢測了培養(yǎng)上清中重組h 幾一2 4 的表達量，為3 3 6 ．5 肛g ／L ，隨后直接用培養(yǎng)上清( 對照為M 1 5 空菌培養(yǎng)上清) 進行了體外誘導腫瘤細胞凋亡的實驗，證實了上清中的h I L ．2 4 具有體外誘導腫瘤細胞凋亡的活性，且對正常細胞沒有影響。說明p Q A B P s ／M 1 5 系統(tǒng)分泌表達有利于外