細胞色素b,5his39和表面酸性殘基對蛋白質結構、性質和功能的影響

1、復旦大學博士學位論文細胞色素bHis39和表面酸性殘基對蛋白質結構、性質和功能的影響姓名：王文虎申請學位級別：博士專業(yè)：無機化學指導教師：黃仲賢2001.11.8置換。為了克服突變體蛋白穩(wěn)定性降低引起的蛋白表達的困難，我們建立了新的蛋白表達體系( p U C l 9 ／J M 8 3 一p E T l l c ／B L 2 1 ( D E 3 ) p l y s S ) ，小試結果表明盡管幾乎所有的突變體基因都得到高效表達，但是沒有發(fā)現(xiàn)

2、能夠在發(fā)酵過程中在宿主菌體內(nèi)結合血紅素的突變體全蛋白。這說明細胞色素6 ，軸向配位突變使得蛋白穩(wěn)定性大幅度降低的困難在我們的體系中也未能避免。我們從構建的細胞色素b ，H i s 3 9 位軸向突變體基因庫中選擇了編碼H i s 3 9 C y s ，H i s 3 9 S e r 和H i s 3 9 G l n 三種含有親水性氨基酸殘基置換的突變體蛋白質的基因進行蛋白質表達，通過純化得到的脫輔基蛋白可以與血紅索在體外重組為突變體全蛋

3、白。這些置換殘基的體積大都小于野生型蛋白中的組氨酸，將可能形成底物結合空穴，殘基的親水性也將提高蛋白質疏水內(nèi)核對極性底物的親和性，這些都將有利于突變體蛋白質實現(xiàn)催化反應功能。選擇它們的原因還在于這三種突變體的3 9 位殘基分別具有以S ( C y s ) 、O ( S e r ) 或N ( G i n ) 原子與血紅素鐵離子配位的潛在可能性，這種可能的配位將起到穩(wěn)定全蛋白質的作用，當然外源配體或反應底物也可以使其被競爭而脫離。我們在細胞

4、色素b ，分子疏水內(nèi)核的關鍵軸向配體位置引入了非保守的親水性氨基酸殘基置換，這在該蛋白質分子軸向突變研究工作中尚屬首次。突變體蛋白質的電噴霧質譜結果表明實驗測得的突變體蛋白質的分子量與理論計算分子量相當吻合，從而證實了我們成功地實現(xiàn)了基因突變并獲得了高純度的目標突變體蛋白質。熱變性實驗的結果證明了所有突變體蛋白的血紅素輔基結合穩(wěn)定性相對于野生型均大為降低。外源配體一瞇唑可以起到穩(wěn)定H i s 3 9 S e r 和H i s 3 9 G

5、 l n 的作用，而在沒有外源配體的情況下，這兩種突變體的全蛋白均不能在室溫下穩(wěn)定存在。從光譜電化學實驗得到的突變體蛋白氧化還原電位較之野生型蛋白質都有大幅度的負移，這也預示了突變體的功能變化。三種突變體蛋白質的電子吸收光譜與野生型蛋白的光譜結果相比都有很明顯的改變，這些性質的變化反映了蛋白質軸向配位環(huán)境的變動：氧化態(tài)的H i s 3 9 S e r和H i s 3 9 G l n 突變體蛋白質擁有H i s 6 3 - - h e m

6、 e ．F e ( I I I 卜_ H 2 0 形式的六配位環(huán)境，血紅素鐵離子處于高自旋狀態(tài)，而還原態(tài)蛋白質血紅素亞鐵離子主要處于H i s 6 3 - - 1 a e m e —F e ( n ) - - - S e r 3 9 ( o r G l n 3 9 ) 六配位環(huán)境和低自旋狀態(tài)：氧化態(tài)的H i s 3 9 C y s 突變體蛋白質則擁有H i s 6 3 - - h e m e —F e ( I I I 卜_ c y s