hiv-1gp41c-螺旋模擬位的篩選和鑒定

1、劉北 一等 H ／ V ． 1 印4 1C - 螺旋模擬位 的篩選和鑒定 第 9 期 HI V ． 1g p 4 1C ． 螺旋模擬位 的篩選和鑒定①劉北一 朱 平 韓強(qiáng)濤 姜世勃0富 寧 ( 第一軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研 室， 廣州 5 1 0 5 1 5 )中國圖書分類號 1 1 3 9 2 - 3 3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1 0 0 0 - 4 8 4 X { 2 0 0 4} 0 9 ． 0 6 3 3 - 0 4[ 摘 要]

2、目的： 篩選可作為小分子先導(dǎo)化合物的 H I V - 1g p _ 4 1C螺旋模擬位， 為開發(fā)抗 H I V - I 早期感染的小分子藥物奠 定基礎(chǔ)。方法： 以源于 H I V - Ig p _ 4 1N 端的肽 N 3 6 為靶 ， 對噬菌體環(huán)七肽庫進(jìn)行親和篩選。利用 E T , T g A 鑒定噬菌體陽性克隆并 對其進(jìn)行 D N A序列分析。結(jié)果： 3 輪篩選后隨機(jī)挑取 2 6 個(gè)噬菌體克隆， Ⅱ】 s A鑒定表明有 1 6 個(gè)克

3、隆可與 N 3 6 結(jié)合， 將其中 1 O個(gè)克隆 D N A測序并推導(dǎo)氨基酸序列 ， 每一克隆至少含有 2 個(gè)疏水氨基酸， 其中9 個(gè)克隆均有 w w， 7 個(gè)克隆有 W WH保守序列。挑選陽性噬菌體克隆 N 0 ． 8 進(jìn)一步鑒定， 游離 N 3 6 肽阻斷 №． 8 克隆與固相化 N 3 6 結(jié)合 ， ( 3 4 肽競爭抑制 N 3 6 肽與 №． 8 克隆結(jié) 合( I為 1 2 ． 5r I d ) 。結(jié)論 ： 表達(dá) ww保守序列

4、的肽模擬 H I V ． Ig p 4 1C螺旋與 N螺旋結(jié)合 ， 該結(jié)果為設(shè)計(jì)針對 mV介導(dǎo)融膜 的抑制 劑提供技術(shù)支持 。[ 關(guān)鍵詞] H I V - Ig p 4 1 ； N - 螺旋； C ． 螺旋； 模擬位 ； 噬菌體肽庫 S c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no fHI V- 1g p 4 1C- h e l i xmi mo t o p e sd i s p l

5、a y e do np h a g e su UB e i - Y i ， Z H UP 魄 ， H A NQ - 嘴 T a o ， JGS h i - B o ， F UN i n g． D e p a r t m e n to f I m m u n o l o g y ，F(xiàn) i r s tM i l i t a r yM e d i —c a lU n i v e r s i t y， C , u a ． v ~o u5 1 0

6、 5 1 5， C h i n a[ A b s t r a c t ] O b j e c t i v e ： T of r e ds m a l lm o l e c u l a rl e a d sf o ri n h i b i t i o no ne a r l ys t a g eo fH I Vi n f e c t i o nb yi d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t

7、 e r i z a t i o no f t h eH I V - Ig p _ 4 1C - } l e h ) 【 m i m o t o p e s ． Me t h o d s ： F o ri d e n t i f i c a t i o no f t h es p 4 1C - h e l i xm i m o t o p e s ， C 7 Cp h a g ed i s p l a yp e p t i d el i

8、 b r a r yw a sb i o -p a n n i n gb yu s i n gas y n t h e t i cp e p t i d eN 3 6wh i c hw ∞ d e r i v e df r o m t hes p 4 1N-a st a r g e t ． A f t e rt h r e er o u n d so f s c r e e n i n g， p o s i t i v ep hs

9、ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e db yE1 ． T S A a n ds e q u e n c e d ． Re s u l t s ： 1 6o f 2 6p l 1 ￡ l g ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e d t ob i n dwi t h p e p t i d eN 3 6， a n d1 0o f t h e m we r

10、es e q u e n c e d． E v e r yc l o n eo f t e nc l o n e sc o n t a i n sa tl e a s tt w oh y d r o p h o b i cr e s i d u e s ， w h i c hma yd o c ki n t ot heh y d r o p h o b i cp o c k e ti nt h es p 4 1N- h e l 

11、3;i xd o ma i n ． 9o f t h e1 0c l o n e sh a v eac o n s e r v a t i v es e q u e n c eW W ， w h i c hm a yi n i n 3 J ct heW6 2 8a n dW 6 3 1i n C - h e l i xt oi n t e r a c tw it h t h eh y d r o -p h o b i cr e s

12、i d u e s i nt h es p 4 1p o c k e t ． O n ec l o n ee x p r e s s i n gt h ec o n s e r v a t i v es e q u e n c en a m e dd o n eN o ． 8 ( CI 哪 I HC )w a ss e l e c t e d f o rc h a r -a e te r i z a t i o n． T h eb

13、i n d i n gb e t w e e nt hec l o n eNo ． 8a n dN 3 6w a sb l o c k e d b yf r e ep e p t i d eN 3 6． A n dt h eb i n d i n gb e t w e e nc l o n eN o ． 8a n dp e p t i d eN 3 6w a si n h i b i t e d b y p e p t i d

14、ec 3 4 ( I c ~ =1 2 ． 5v c C n a ) ． C o n c l u s i o n ： T n es h or tc i r c u l a rp e p t i d e sd i s p l a y e do np h ~ s e sc o n t a i n i n gWWr e s i d u e sm a ymi i n l ct h ec o n f o r ma t i o n a le p i

15、 t op eo f t h eHI V- Is p 4 1C - h e l i xt oi n t e r a c tw i t h t h eN- ~l i x ． T h i si n f o r m a t i o nm a yb eu s e f u lf ord e s i g no f H I V-1f u s i o ni n h i b i t or s ．【 K e y w o r d s ] H I V 一 1

16、g r i t ； N 一 ~l i x ； C - h e l i x ； M i m o t o p e ； P h a g e d i s p l a yp e p t i d e l i b r a r y已知廣為應(yīng)用 的抗 H I V感染 的雞尾酒療法 主 要針對 H I V感染后期 。 目前 ， 研制控 制早期 病毒感 染且避免雞尾酒療法不 良反應(yīng)的抗 H I V 一 1 新藥備受 關(guān)注。已證 明在病毒介 導(dǎo)融 膜瞬 間，

17、H I V 一 1 跨膜蛋 白 g p 4 1 胞外段羧基端螺旋 ( 稱為 C 一 螺旋 ) 以反向平 行的方式 與氨基 端 的螺旋 區(qū) ( 稱 為 N _ 螺旋 ) 相互作 用 ， 構(gòu)成發(fā)夾三聚體結(jié) 構(gòu)( t f i m e r - o f - h a i r p i n ) 導(dǎo)致病毒 和靶細(xì)胞膜融合?。以 C 一 螺旋 為靶點(diǎn)研制抗 H I V - 1感染早期 的抑制劑 的設(shè)計(jì)原理為 ： 用外源模擬 C 一 螺 旋構(gòu)像的類似物 (

18、包括肽 、 表達(dá)蛋 白、 化合物等) 與內(nèi)① 國家 自然科學(xué)基金海外合 作基金資助項(xiàng) 目( 3 0 0 2 8 0 2 1 )②紐 約血 液中心 L F K研究所 ， N Y1 0 0 2 1作 者簡介 ： 劉北一( 1 9 6 9 年 一) ， 女 ， 博士研究生 ；指 導(dǎo)教師 ： 富 寧 ( 1 9 5 3 年 一) ， 女 ， 教授 ， 博 士生 導(dǎo)師 ， 主要 從事抗 感 染免疫研究 。源性 N _ 螺旋結(jié)合可阻斷病毒 自身 C

19、 一 螺旋和 N _ 螺旋作 用 ， 如根據(jù) C 一 螺旋一級序列合成 的多肽 ( 稱為 C肽)包括 S J 一 2 1 7 6 ， C 3 4 ， D P 1 7 8 ， T 2 0 及表達(dá)蛋白5 一 H e l i x 均可 有效抑制 H I V - 1 介導(dǎo) 的融膜 ， I達(dá) I水平 ] 。其 中( 商品名稱為 E n f u v i r t i d e ， E N F ) 已進(jìn)人臨床Ⅲ期，但仍存在分子量大、 臨床用量大、 不能

20、口服及價(jià)格 昂 貴等問題。因此篩選抗 H I V介導(dǎo)融膜早期 的小分子 先導(dǎo)化合物成為一個(gè)具挑戰(zhàn)性 的探索。1 9 9 9 年姜世 勃等利用分子對接技術(shù) ( m o l e c u l a rd o c k i n gt e c h n i q u e s )篩選 2 00 0 0 個(gè)化合物獲得小分子抑制劑 A DJ l ( 7 一 [ 《 ； _p h e n y l a m i n o - g 【 4 - ( 3 ， 5 一 d i

21、 s u l f o - 8 - h y d r o x y n a p h t h y 1 ) a z o ] 一 2 -m e t h o x y - 5 一 r ~t h y l p h e n y l a m i n o] 一 l ，3 ，5 一 t r a z i n 一 2 - y 1 ] - 4 -h y d r o x y - 3 一 【 ( 2 - m e t h o x y 一 5 一 s u l f o p h e

22、 n y l- a z o ] 一 2 - n a p h t h a l e —n e s u l f o n i ca c i d ， M W： ll 7 7D a )J ， 同年， K i m等利用鏡 像噬菌體展示 ( m i r r o r - i m a g ep h a g ed i m p l y ) 得到環(huán)形 D維普資訊 http://www.cqvip.com =釜—_ L 避量縫造塑鱉塞筮 2 塑游Bl離o d多d

23、~ 肽竺 ． 8 噬 菌 體 克 隆 與結(jié) 合 go r2BNo性． 8p h ag ec l o n 豁ea n d i o - N3 6bByf r e eN3 6If p g ， mI J一。 墑 n— · 一 R e 。n tb o豢 合 I oN 咖 ： № 卜a g ec 】 眺 ； N0 ． 2 7 ： u n r e I； N 0． 2 8 ： c 7 cI j b 岫 ，． ?No．． 8， 噬菌體克隆