中國HIV-1B亞型Gag、Nef、Pol和Env區(qū)保守性CTL表位的鑒定.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）絕大多數(shù)是由人類免疫缺陷病毒I 型（HIV-1）引起的全球流行的傳染病，并成為人類主要的致死性疾病之一。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織公布的《2006 年世界艾滋病報告》估計，自1981 年首次發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者以來，2006 年全球感染人數(shù)已達(dá)3950 萬人，新增430 萬名患者。全球每天有1.1 萬人感染HIV，同時每天有8000 名感染者死亡。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART）雖能降低部分患

2、者病毒含量，重建部分免疫功能，延緩病情發(fā)展，改善癥狀，但因藥物副作用而使許多患者難以耐受，依從差，更為重要的是HAART 不能完全清除病毒。所以尋找有效HIV-1 疫苗是目前迫切需要解決的問題。大量研究證明細(xì)胞免疫特別是HIV-1 特異性CTL 應(yīng)答反應(yīng)在控制HIV-1 感染中起關(guān)鍵作用，故研發(fā)以誘導(dǎo)HIV-1 特異性CTL 應(yīng)答為目的的疫苗意義重大。開發(fā)此類疫苗首先要確定能誘導(dǎo)強的HIV-1 特異性CTL 應(yīng)答并具有廣泛免疫原性的特異

3、性表位。有效的HIV-1 特異性CTL 應(yīng)答不僅由抗原結(jié)構(gòu)決定，同時受HLA-I 等位基因限制，因此在篩選和鑒定具有強的和廣泛作用的HIV-1 特異性CTL 表位時，研究表位的HLA-錯誤！未找到引用源。類分子的限制性是不可缺少的工作。不同人群HLA-錯誤！未找到引用源。等位基因分布頻率不同，決定了不同人群HIV-1 的CTL 應(yīng)答模式不同，所以在不同人群篩選可用于研制疫苗的表位非常必要。中國作為世界人口最多的國家，存在許多潛在的HIV

4、-1 蔓延危險因素，2006 年底統(tǒng)計估計已有65 萬人感染HIV-1，開發(fā)有效疫苗是控制HIV-1感染的最佳途徑。中國人群常見HLA-錯誤！未找到引用源。等位基因分布頻率不同于白種人群，HIV-1 病毒主要流行株與國外也存在差異，這就決定了中國人群對HIV-1 的CTL 應(yīng)答模式不同于白種人及黑人。故篩選出中國人群常見等位基因限制的HIV-1 特異性CTL 表位將對研發(fā)針對中國人群誘導(dǎo)特異性CTL 應(yīng)答的HIV-1 疫苗具有重要的現(xiàn)實

5、意義。 HIV-1B 亞型是中國的主要流行亞型，同時HIV-1B 亞型誘導(dǎo)的特異性CTL 應(yīng)答具有交叉性，因此，本研究選擇HIV-1B 亞型感染者為研究對象，用ELISpot 法檢測覆蓋HIV-1B 全基因序列肽庫誘導(dǎo)的CTL 應(yīng)答反應(yīng)，分析中國人群HIV-1B 感染者HIV-1 特異性CTL 應(yīng)答特征，確定免疫優(yōu)勢應(yīng)答區(qū)域。通過對病毒基因和多肽序列進(jìn)行分析，進(jìn)一步篩選出具有保守性的免疫優(yōu)勢區(qū)域，結(jié)合對患者HLA-錯誤！未找到

6、引用源。基因分型，選擇攜帶中國人群常見等位基因并對該區(qū)域應(yīng)答的患者，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已確定的表位，對這些區(qū)域中常見等位基因限制的表位進(jìn)一步確證，從而篩選出可用于研發(fā)針對中國人群的HIV-1 疫苗所需表位。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1．采用多重套式PCR 方法擴增Gag 基因，根據(jù)結(jié)果確定12 例HIV-1B 感染者。結(jié)合以前分型結(jié)果，共選擇66 例感染者為研究對象，用PCR-SSP（系列特異性引物）技術(shù)鑒定HLA-I 型

7、等位基因分型，發(fā)現(xiàn)研究人群8 個HLA-錯誤！未找到引用源。類基因型A*02，A*24，A*11，B*13，Cw*03，Cw*07，Cw*01，Cw*06 分布頻率大于10％，與以前的結(jié)果一致，基因型B*15，B*40 略低于大規(guī)模調(diào)查結(jié)果，提示本研究人群能較好的代表中國人群。 2．用ELISpot 法檢測HIV-1B 感染者覆蓋HIV-1B 全基因共享序列肽庫誘導(dǎo)的CTL 應(yīng)答反應(yīng)，共發(fā)現(xiàn)14 個免疫優(yōu)勢區(qū)，分布在Gag、P

8、ol、Env、Nef蛋白區(qū)，其中6 個位于Gag 區(qū), 1 個位于Pol 區(qū), 3 個位于Env 區(qū)，4 個位于Nef 區(qū)，與白種人群和非洲人群觀察的結(jié)果相似，但從每個蛋白的具體肽段分析，則存在明顯差異。 3．對部分病毒基因測序，結(jié)合Los Alamos 數(shù)據(jù)庫中已公布的中國地區(qū)HIV-1B亞型序列對確定的14 個免疫優(yōu)勢區(qū)進(jìn)行分析，除位于Pol 的免疫優(yōu)勢區(qū)外，其他免疫優(yōu)勢區(qū)基因序列變異程度顯著低于相對應(yīng)全基因序列，氨基酸序

9、列變異程度顯著低于相應(yīng)蛋白氨基酸序列，提示這些免疫優(yōu)勢區(qū)具有高度的保守性。 4．在確定的免疫優(yōu)勢區(qū)中發(fā)現(xiàn)21 個中國人群常見等位基因限制的表位，其中11 個表位(VKVVEEKAF,EKAFSPEV,FSPEVIPMF, SPEVIPMF, VIPMFSAL,TPQDLNTM, EGATPQDL，GQMREPRGSDI,YVDRFYKTL，RDYVDRFFKT, TLRAEQATQD)位于Gag 區(qū),6 個表位（QVPLRPM

10、TYK, WIYHTQGYF，TQGYFPDWQNY，GYFPDWQNY, YFPDWQNYT, NYTPGPGVRY）位于Nef 區(qū)；4 個表位（LWVTVYYGV，TVYYGVPVWK，VYYGVPVWKEA，RAIEAQQHL）位于Env 區(qū)。由于Nef 區(qū)表位誘導(dǎo)的CTL 應(yīng)答可能是非保護(hù)性的，故疫苗設(shè)計中應(yīng)注意刪除，而位于Gag 和Env 區(qū)的表位誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答可能具有保護(hù)作用，可用于構(gòu)建針對中國人群的HIV疫苗。