吸水鏈霉菌5008產井岡霉素與黑色素的相關性研究.pdf

1、井岡霉素(Validamycin A，Val-A)是一種安全高效的抗真菌抗生素。吸水鏈霉菌5008是常用于工業(yè)化發(fā)酵生產井岡霉素的放線菌株，使用至今已有40余年。在吸水鏈霉菌5008發(fā)酵過程中，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中同時有一種黑色素產生，且隨著發(fā)酵時間的延長色素量逐漸增加，是井岡霉素發(fā)酵過程中的一種重要副產物。本研究針對該色素與井岡霉素的產生有何相關性進行研究，從井岡霉素產量與色素液吸光值的關系入手，利用qRT-PCR技術，推測兩者在代謝通路

2、上的相關性，并將發(fā)酵液中的黑色素進行提取，在對色素理化性質及穩(wěn)定性等研究的基礎上，建立了一種Val-A快速檢測方法，同時利用FT-IR紅外光譜分析等方法對色素物質結構進行初步推測。在提取發(fā)酵液中的井岡霉素時，將發(fā)酵液中的色素分離出來，可達到對發(fā)酵產品更充分的利用，同時也為該色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　主要研究結果如下:
　　1.井岡霉素與黑色素產量的關系
　　Val-A的合成與色素的分泌在改變不同發(fā)酵條件情況下，

3、如改變培養(yǎng)基、改變發(fā)酵溫度、添加外源刺激物等，所呈現(xiàn)出的對環(huán)境改變的反應趨勢是一致的，當處于優(yōu)勢環(huán)境中時，兩者的合成量共同增加，當處于劣勢環(huán)境中時，兩者的合成量則共同減少。這表明，Val-A的合成與色素的分泌是具有一個穩(wěn)定的相關性的。
　　2.井岡霉素與黑色素相關基因表達情況
　　針對井岡霉素合成結構基因（valABC, valKLMN, valG）、色素編碼基因(SHJG4405)及兩個相關的全局調控基因（ugp，afsR

4、）在不同發(fā)酵條件下的表達情況進行了研究。當發(fā)酵處于劣勢環(huán)境中，如低產培養(yǎng)基、低溫培養(yǎng)等條件，井岡霉素合成結構基因、色素編碼基因和兩個全局調控基因的表達水平在不同的生長時期均有顯著性下降，同樣的，在優(yōu)勢環(huán)境中，如添加外源刺激物或改變初始pH值條件下，這些基因都會在不同生長時期有不同水平的顯著性上調，整體上表現(xiàn)出一種與產量相關的協(xié)同性。
　　3.色素理化性質及其穩(wěn)定性研究
　　本研究從吸水鏈霉菌5008發(fā)酵中將黑色素提取出來，采

5、用光譜法研究了光、溫度、pH、還原劑、氧化劑、金屬離子和食品添加劑對該色素穩(wěn)定性的影響。結果表明:該色素具有較好的光、熱穩(wěn)定性和抗紫外輻射能力，具有一定的抗氧化性和抗還原性;pH值對該色素影響較明顯，強酸性條件下色素會產生沉淀并變色，中、堿性條件下較穩(wěn)定;Ca2+、Mn2+、Fe3+對色素的影響較大，Al3+能夠對色素起到保色作用，而Mg2+、K+、Na+對色素影響較小;常見食品添加劑蔗糖和葡萄糖能增加色素穩(wěn)定性，碳酸氫鈉、苯甲酸鈉對色

6、素穩(wěn)定性影響較小。
　　4.色素物質結構分析
　　通過與其他天然黑色素紅外光譜圖進行比較得知，該色素具有黑色素的共性，即基本結構單元是吲哚環(huán)，但由于不同來源黑色素某些基團有所差異，結構上存在不同，吸收峰不完全一致。初步判斷該色素屬于真黑素和棕黑素的混合型黑色素。
　　5.快速檢測方法
　　我們將井岡霉素產量與色素吸光值進行關聯(lián)，確定了兩者之間的擬合關系為y=19.410x4-51.750x3+39.262x2+8

7、.604x-0.643，其中x為發(fā)酵液的OD450，y為Val-A的濃度，該擬合公式的Adj R-square達到了0.9928，表現(xiàn)出相當高的準確度，在未來工業(yè)發(fā)展中具有廣闊的應用前景。
　　6.一種提高井岡霉素產量的方法
　　本實驗利用微生物的群體感應現(xiàn)象，提前向發(fā)酵液中添加含群體感應信號分子的發(fā)酵上清液，利用群體感應信號分子對其進行刺激，激活群體感應通路的響應，促進相關基因的表達，使得某些次級代謝物的分泌提前進行，提高