速凍面米制品中金黃色葡萄球菌的快速定量檢測(cè)及分型.pdf

1、本研究從市售速凍面米制品中按照國(guó)標(biāo)方法（GB4789.10-2010）進(jìn)行金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的分離及鑒定，同時(shí)用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證；在不進(jìn)行前增菌的情況下，比較了四種基因組DNA提取方法（CTAB法、離心柱法、羧基化納米磁珠法和氨基化納米磁珠法）從速凍面米制品中直接提取金黃色葡萄球菌 DNA的效率和純度；將磁珠分離與TaqMan Real-time PCR結(jié)合，建立了快速定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌污

2、染水平的方法；針對(duì)速凍面米制品中的金黃色葡萄球菌分離株，使用PCR方法對(duì)其中腸毒素基因的分布多樣性進(jìn)行了篩查，并結(jié)合多位點(diǎn)序列分型（MLST），探討了各基因型毒力因子的分布規(guī)律。
　　本研究的主要內(nèi)容如下：
　?。?）共采集速凍面米制品樣品（肉餡類、素餡類和無餡類）288份，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離和鑒定，并PCR擴(kuò)增nuc1基因進(jìn)行確證。結(jié)果有88份樣品檢出了金黃色葡萄球菌，陽性檢出率達(dá)到了30.56%，其中肉

3、餡類速凍面米制品中檢出率為41.44%，高于其他兩類；從88份陽性樣品中一共獲得了124株金黃色葡萄球菌分離株。
　　（2）對(duì)CTAB法、離心柱法、羧基化納米磁珠法和氨基化納米磁珠法等四種DNA提取方法進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)氨基化納米磁珠法在提取DNA的效率和純度方面表現(xiàn)最佳，在不進(jìn)行增菌的情況下可直接從速凍面米制品中提取金黃色葡萄球菌 DNA，有效消除蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，并且在1.5 h內(nèi)即可完成DNA的提取。
　?。?）氨

4、基化納米磁珠分離法與TaqMan探針法Real-time PCR結(jié)合使用可實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)，4h內(nèi)即能得到最終結(jié)果，大大降低檢測(cè)時(shí)間。使用該方法在32份陽性樣品中進(jìn)行驗(yàn)證，得到的結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法BP平板計(jì)數(shù)結(jié)果沒有顯著性差異（p>0.05），該方法準(zhǔn)確度較高。
　?。?）使用建立的快速定量檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)法對(duì)陽性樣品進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果顯示肉餡類樣品中金黃色葡萄球菌污染量最高，達(dá)到了2.00×103~1.21×105 CFU/g，素餡類

5、中為7.88×102~7.89×103 CFU/g，無餡類中為4.68×102~5.60×103 CFU/g，88份陽性樣品中有6份肉餡類樣品超過了新國(guó)標(biāo)規(guī)定的最大允許檢出量（104 CFU/g）。
　?。?）對(duì)得到的124株金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，篩查了18種腸毒素基因（sea-see，seg-ser，seu）的分布情況。結(jié)果顯示：高達(dá)89.52%（111/124）的食源性分離株都攜帶有腸毒素基因；最多攜帶10種腸

6、毒素基因的有5株；僅有13株菌不含所檢測(cè)的18種腸毒素基因；18種腸毒素基因中，檢出率最高的是sep，攜帶率高達(dá)44.35%（55/124)，其次是sei（43.55%）和seg（42.74%），這三種基因的攜帶率都超過了40%。
　?。?）對(duì)124株金黃色葡萄球菌食源性分離株進(jìn)行了多位點(diǎn)序列分型（MLST），結(jié)果共有36個(gè)ST型，其中31個(gè)為數(shù)據(jù)庫(kù)中已有ST型，5個(gè)為新ST型（new-1~new-5）。菌株數(shù)目最多的為ST-7（

7、21.77%，27/124），依次為 ST-1（7.26%，9/124）、ST-5和ST-25（各5.65%，7/124）；ST-9、ST-15、ST-2871、ST-188等也比較常見。36個(gè)ST型分布在19個(gè)克隆系（CCs）中，CC7是這124株食源性分離株中最流行的克隆系（29.84%，37/124），其次是CC5和CC15（8.87%，11/124）；CC7（ST7、ST306、ST943）和CC239（ST630、ST239、

8、ST3159）是多樣性最大的克隆系，均包含3個(gè)不同的ST型。結(jié)合腸毒素基因攜帶情況，發(fā)現(xiàn)ST-7型無論是菌株數(shù)量還是攜帶腸毒素基因數(shù)目都是最多的；CC30、CC9、CC72、CC5和CC25平均比其他克隆系攜帶更多腸毒素基因；傳統(tǒng)腸毒素基因基本分布在CC1、CC5、CC25和CC7中。
　　本研究從速凍面米制品中進(jìn)行了金黃色葡萄球菌的分離鑒定、建立了快速定量檢測(cè)方法、篩查了腸毒素基因的分布情況并進(jìn)行了MLST分型，為快速定量檢測(cè)食