基于toehold鏈置換輔助目標(biāo)循環(huán)放大的新型熒光生物傳感器的研究.pdf

1、熒光生物傳感器是一種將特定分子識(shí)別事件與熒光轉(zhuǎn)換過(guò)程相結(jié)合的裝置。由于它們具有設(shè)備簡(jiǎn)單、選擇性好和響應(yīng)快速等的優(yōu)點(diǎn)，自從首次構(gòu)建，便被期望在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全中發(fā)揮重要的分析作用。然而，在實(shí)際分析檢測(cè)中目標(biāo)物的濃度通常處于相對(duì)較低的水平，這就需要研究人員設(shè)計(jì)信號(hào)放大策略來(lái)提高傳感器的靈敏度。考慮到酶輔助循環(huán)放大反應(yīng)容易受到溫度、酸堿度等環(huán)境因素的影響，因此本研究主要致力于開發(fā)簡(jiǎn)單、方便的非酶信號(hào)放大方法用于檢測(cè)不同的目標(biāo)分子，

2、并獲得了一系列有效的結(jié)果。我們將所進(jìn)行的研究工作的具體內(nèi)容總結(jié)如下：
　　1. MicroRNA激活的分子機(jī)器用于非酶目標(biāo)循環(huán)放大檢測(cè)癌細(xì)胞中的microRNA
　　失調(diào)表達(dá)的 microRNA可以作為不同癌癥早期診斷的有用的生物標(biāo)志物。基于新穎的目標(biāo)激活的非酶目標(biāo)循環(huán)放大DNA機(jī)器，本文提出了一種簡(jiǎn)單高靈敏的熒光方法用于檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中的 microRNA。目標(biāo)物 miR-141與熒光猝滅的 DNA復(fù)合探針的末端區(qū)域進(jìn)行

3、toehold鏈置換反應(yīng)(TSDR),導(dǎo)致了FAM標(biāo)記的信號(hào)探針從復(fù)合探針中釋放，并且產(chǎn)生了另一個(gè) toehold區(qū)域用于隨后與燃料鏈雜交。一旦與該 toehold區(qū)域結(jié)合，燃料鏈便通過(guò)第二個(gè)toehold鏈置換反應(yīng)置換了雜交在復(fù)合探針上miR-141并且激活了該DNA機(jī)器，使得miR-141進(jìn)行目標(biāo)物循環(huán)并導(dǎo)致大量的釋放信號(hào)探針用于放大檢測(cè) miR-141，其檢測(cè)限達(dá)到80fM。該方法也展示了高的選擇性，同時(shí)可以用于監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞中的 m

4、iR-141。此外，我們構(gòu)建的方法避免了使用蛋白酶進(jìn)行目標(biāo)物循環(huán)放大，因此在未來(lái)的生物分析領(lǐng)域可以提供重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.目標(biāo)響應(yīng)適配體機(jī)器用以免標(biāo)記的和靈敏的非酶循環(huán)放大檢測(cè)ATP
　　ATP的濃度異常與許多疾病相關(guān)，開發(fā)簡(jiǎn)單和靈敏的方法用于鑒定和檢測(cè)ATP在臨床診斷中至關(guān)重要。在這項(xiàng)工作中，基于一種新穎的ATP響應(yīng)分子適配體機(jī)器，我們開發(fā)了一種非酶信號(hào)放大方法，這種方法可以敏感的檢測(cè)人類血清中的ATP。目標(biāo)ATP與

5、三鏈DNA復(fù)合探針中的 ATP適配體結(jié)合使得該適配體的構(gòu)型改變，并導(dǎo)致 toehold區(qū)域的暴露。燃料DNA隨后雜交到該區(qū)域上，通過(guò)toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)釋放了G-四鏈體活性序列和目標(biāo)ATP。這樣，ATP分子可以循環(huán)再利用使得釋放許多G-四鏈體活性序列，這些被釋放的活性序列與 N-甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）結(jié)合產(chǎn)生顯著放大的熒光信號(hào)，用于靈敏的檢測(cè)低至25nM的 ATP。此外，這種方法對(duì)于其他對(duì)照分子也展示出高選擇性，并且可

6、以用于檢測(cè)稀釋的血清樣品中的 ATP。另外，我們的方法避免使用酶和納米材料進(jìn)行信號(hào)放大，也未標(biāo)記信號(hào)讀出探針。因此，經(jīng)過(guò)精心的改進(jìn)設(shè)計(jì)，這里提出的傳感平臺(tái)具有很大的潛力用于簡(jiǎn)單的和敏感的檢測(cè)其他小分子。
　　3.金屬toehold激活催化發(fā)夾組裝形成的三向DNAzyme連接體用于放大熒光檢測(cè)汞離子
　　由于汞離子對(duì)環(huán)境和人體不可逆的毒性影響，開發(fā)一種可靠的并具有高選擇性和靈敏的汞離子檢測(cè)方法具有重要意義。借助于通過(guò)金屬 to

7、ehold觸發(fā)催化發(fā)夾組裝（catalytic hairpin assembly, CHA）形成的三向DNAzyme連接體的高效的信號(hào)放大能力，我們構(gòu)建了一種可用于測(cè)定不同水環(huán)境樣品中汞離子的高靈敏和高選擇性的方法。存在目標(biāo)汞離子可導(dǎo)致形成T-Hg2+-T堿基錯(cuò)配金屬toehold結(jié)構(gòu)，這樣便觸發(fā)了含有分裂DNAzyme的三個(gè)發(fā)夾經(jīng)過(guò)催化組裝以形成依賴于鎂離子進(jìn)行底物鏈剪切的 DNAzyme連接體。接著，鎂離子循環(huán)切割熒光猝滅的底物鏈結(jié)