微生物發(fā)酵過程還原糖光度傳感器的研究.pdf

1、我國發(fā)酵工業(yè)是一個品種繁多，門類齊全，具有相當規(guī)模的獨立工業(yè)體系。產(chǎn)品包括酒類、有機酸、抗生素、酶制劑、淀粉糖、氨基酸、核苷酸、維生素、有機溶劑、微生物殺蟲劑、植物激素、單細胞蛋白等。應用領域涉及醫(yī)藥、衛(wèi)生、輕工、化工、農(nóng)業(yè)、能源、環(huán)保等諸多行業(yè)；其中，味精、檸檬酸、酶制劑、酵母產(chǎn)量居世界前列。發(fā)酵工業(yè)已成為國民經(jīng)濟的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。 發(fā)酵過程的在線檢測和自動控制是發(fā)酵工業(yè)技術進步的重要發(fā)展方向。傳感器技術作為發(fā)酵過程信息的發(fā)

2、生源，對實現(xiàn)發(fā)酵過程的在線檢測和自動控制起到關鍵作用。然而，目前我國發(fā)酵生產(chǎn)上發(fā)酵過程自動化控制程度不高，落后于其他領域。用于發(fā)酵生產(chǎn)中的傳感器主要是進行罐內(nèi)物化參數(shù)的測定。此類傳感器的性能較穩(wěn)定，應用也較為普遍，實現(xiàn)了部分參數(shù)的在線監(jiān)控。但與發(fā)酵最優(yōu)化的自動控制目標相去甚遠，即難以成功建立對培養(yǎng)過程進行系統(tǒng)的反饋性控制。因為發(fā)酵過程是一個非性線、多變量和隨機性的動態(tài)過程，發(fā)酵體系是一個復雜的被控對象。溫度、溶氧、pH、培養(yǎng)基成分、細胞

3、形態(tài)、細胞濃度、產(chǎn)物組成及含量等均是發(fā)酵過程的重要控制參數(shù)。隨著計算機及控制技術的突飛猛進，生物傳感器技術的發(fā)展，發(fā)酵動力學模型研究的完善，發(fā)酵過程控制系統(tǒng)愈來愈多，應用范圍亦越來越廣。但是，工業(yè)上實現(xiàn)發(fā)酵過程最優(yōu)化自動控制的實例卻不多，仍以人工控制和半自動控制為主。其發(fā)展滯后的重要原因之一就是基于細胞代謝的生化參數(shù)信息的缺乏。 葡萄糖(還原糖)作為微生物的主要碳源和能源，是發(fā)酵過程中重要的生化控制參數(shù)，它在培養(yǎng)基中的含量及在發(fā)

4、酵過程中的濃度變化直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量、收率和生產(chǎn)成本。目前實際生產(chǎn)過程中常采用傳統(tǒng)的手工滴定法或比色法進行還原糖的測定，這些方法操作繁瑣、人為誤差大，給企業(yè)生產(chǎn)管理帶來很多麻煩，也嚴重阻礙了發(fā)酵過程在線檢測和自動控制技術的應用。解決還原糖測定的傳感器技術成為發(fā)酵工業(yè)迫切需要解決的技術難題之一。 生化傳感器是一種集電子科學、生物化學和材料科學于一體的新型的分析技術，它是將生化物質(zhì)(待測物質(zhì))通過敏感器件，定量和高選擇性地轉(zhuǎn)化為

5、可監(jiān)測的光電信號，并由電子儀器進行信息分析、處理，得到相關環(huán)境的生化物質(zhì)的信息。它從上世紀80年代起，生化傳感器技術和市場有了較快的發(fā)展，在環(huán)境監(jiān)測、臨床醫(yī)學檢測、食品安全檢測、發(fā)酵過程控制、石油化工等領域廣泛應用。但有關還原糖檢測的傳感器技術研究和應用報道不多。 很多分析儀器可以進行還原糖或葡萄糖的測定，但對于發(fā)酵樣品中還原糖測定，這些儀器分析方法操作繁瑣、測定時間長，測定成本高，不能適合發(fā)酵生產(chǎn)過程大批量、高頻率測定的實

6、際要求。本研究根據(jù)還原糖氧化還原滴定原理，將生化技術與光、電技術相結(jié)合，建立一種智能化、實用化的生化傳感分析系統(tǒng)，用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程還原糖的快速檢測。 采用光度傳感器作為信號檢測器件，響應速度快，適用環(huán)境廣，且傳感器不直接與反應溶液接觸，性能更加穩(wěn)定，比離子電極具有更大的優(yōu)勢。。但對于發(fā)酵樣品的特殊性，如菌體引起的液體濁度、發(fā)酵液的顏色等，光度傳感器與常規(guī)的吸光光譜分析方法一樣面臨光度測量的干擾問題；而且，發(fā)酵過程菌體濁度

7、隨發(fā)酵時間的不同而變化；另外，還原糖化學分析過程常涉及高溫，斐林試劑滴定要在沸騰狀態(tài)下進行。因此，解決樣品的干擾和溫度控制這兩方面的問題是本研究的主要技術難點。 在最初的設計方案中曾采用流動注射吸光光譜方法進行還原糖的測定。這一測試系統(tǒng)可以對一些簡單樣品進行還原糖測定、如蜂蜜、葡萄糖試劑等。對發(fā)酵樣品仍需要離心、過濾、活性碳脫色后測定。因為，樣品的濁度直接影響到光吸收面積或峰值的大小。還原糖容量分析法是根據(jù)滴定終點滴定液消耗

8、體積來計算被測樣品中還原糖含量。因此，只要通過光度測定準確判斷終點就可以完成測定。本研究采用單色光電二極管作為光源，硅光電池作為光信號轉(zhuǎn)換器，進行還原糖滴定反應終點顏色變化的判斷。但在測定時，一次進樣量過多，液體濁度和顏色增加，影響傳感器信號的產(chǎn)生。對26小時谷氨酸發(fā)酵液測定實驗表明，進樣量超過800 μ1，傳感器電壓信號最大值低于0.26 mv，滴定終點不能出現(xiàn)可檢測的突變電壓信號。本系統(tǒng)通過調(diào)整反應池體積和試劑濃度，控制進樣量在5

9、00μ1以內(nèi)，則發(fā)酵液濁度、顏色對測定結(jié)果不產(chǎn)生影響。 溫度控制要解決兩個問題，一個是加熱速度，一個是加熱產(chǎn)生的氣泡干擾。傳統(tǒng)的液體加熱方式主要是采用電熱絲，如電爐或加熱棒。這種加熱方式簡單、方便，但加熱速度慢，溫度滯后效應大。Andre(1999)曾在流動注射分析中采用微波爐加熱法測定葡萄酒中還原糖。該法能快速提升液體溫度，無溫度滯后，但不具備實用價值。歐姆加熱(Ohmic heating)，也叫電阻熱(Resistance h

10、eating)，焦耳加熱(Joule heating)，是食品加工領域的一項新技術。其原理是利用交流電流通過液體內(nèi)部產(chǎn)生的電阻抗特性加熱。特點是沒有傳熱面(或很小)，不會產(chǎn)生傳統(tǒng)換熱器在高溫下易結(jié)垢、結(jié)焦的現(xiàn)象。本研究通過對電熱絲加熱和歐姆加熱的比較，探討了歐姆加熱方式在該系統(tǒng)中的應用特性，建立了歐姆加熱的使用方法，使液體溫度在25s內(nèi)達到98—100℃。 但加熱產(chǎn)生的氣泡對光電傳感器電壓信號有較大的干擾。特別是加熱產(chǎn)生的大

11、氣泡能引起電壓信號的突變，其變化量接近或超過滴定終點的電壓變化，造成滴定終點誤判。本系統(tǒng)中，滴定液經(jīng)加熱套預加熱，使溫度達到50—60℃后進入反應池，大大減少了反應池內(nèi)加熱電極的加熱強度，減少了突發(fā)性大氣泡的產(chǎn)生。同時，該系統(tǒng)中連接光源和光電轉(zhuǎn)換器之間有一個多孔的光通道，在攪拌的作用下，反應液體和小氣泡可以均勻透過，而液體中大氣泡不能直接通過。小氣泡也能引起電壓信號變化，但其變化量不足滴定終點時的1/30，且分布均勻，不會引起檢測器電壓

12、的突變。在終點時，指示劑次甲級蘭的顏色消失引起的光電電壓變化明顯高于氣泡引起的變化。因此，加熱氣泡不會干擾光電信號的采集。 針對發(fā)酵樣品的特殊性和試驗過程中遇到的問題，設計出還原糖傳感器電路和控制軟件，設計出微型反應池和相應的測試系統(tǒng)硬件；研究了以LED光電檢測系統(tǒng)為基礎的斐林試劑測定還原糖的光學響應特征、光度測定的抗干擾性能；建立了還原糖測定方法和淀粉糖化過程的在線檢測技術。傳感器性能指標達到以下要求： 1、傳感器

13、操作簡單，測定時只需用微量注射器將被測樣品注入反應池即可全自動完成；測定速度快，測定時間在3-4分鐘；結(jié)果準確，還原糖在0-1.0％范圍內(nèi)，線形相關系數(shù)為0.9998，精密度(RSD％)為1.14(n=10)；抗干擾能力強，樣品不需要過濾、脫色處理可直接測定，回收率為98-103％；測試成本較低，試劑消耗量低于常規(guī)滴定方法。 2、在線檢測系統(tǒng)對10.0％還原糖樣品連續(xù)測定精密度(RSD％)為2.32(n=10)：還原糖在0-18

14、％范圍內(nèi)線性相關系數(shù)為0.9932；在線檢測滯后時間小于7分鐘。在實際生產(chǎn)中可連續(xù)33小時自動測定淀粉糖化生產(chǎn)過程還原糖變化，系統(tǒng)運行正常。 在以上研究基礎上，將還原糖測定與葡萄糖酶電極測定技術相結(jié)合，初步研究了谷氨酸發(fā)酵過程微生物對葡萄糖、還原糖的代謝規(guī)律和淀粉糖化過程葡萄糖、還原糖的變化特點。 對13個淀粉糖化樣品的測試結(jié)果表明：糖化樣品DE值在95以上，且顏色淺，透光率好，按常規(guī)質(zhì)量標準衡量基本一致。但樣品中葡

15、萄糖/還原糖值變化較大。葡萄糖/還原糖比值變化從80％-94.2％；其中，11、12號樣品還原糖含量差別僅有0.2％，而葡萄糖/還原糖比值相差8％以上。 對谷氨酸發(fā)酵過程還原糖和葡萄糖含量變化的測定結(jié)果顯示：發(fā)酵開始時，發(fā)酵液中還原糖含量高于葡萄糖1.09％：葡萄糖/還原糖為92％；在0.8小時之間，還原糖代謝速率為0.215％，葡萄糖為0.225％；8小時以后，谷氨酸發(fā)酵代謝速率明顯提高，在10-24小時，還原糖與葡萄糖平均