布魯桿菌Ⅱ型MEP合酶的制備表征及其催化機(jī)制的初步探索研究.pdf

1、背景:隨著抗生素耐藥性問題不斷加劇，對多種疾病可選用的治療辦法正在耗盡，臨床上迫切需要新型抗生素的研究與開發(fā)。類異戊二烯化合物合成過程中的關(guān)鍵酶2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)合成酶，又稱1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)化酶(DXR)是最有前景的抗生素篩選靶標(biāo)之一。以DXR為靶點(diǎn)篩選的抗生素膦胺霉素具有用于治療由多重耐藥菌和惡性瘧原蟲(Plasmodium)引起的感染的潛力。最新的研究發(fā)現(xiàn)一些主要致病菌如巴爾通體屬（Ba

2、rtonella）和布魯桿菌屬（Brucella）的菌體內(nèi)不存在DXR蛋白，而是被一種DRL酶(DXR-like，或稱Ⅱ型DXR)所替代。雖然DRL與DXR的功能相同，但是兩者無論是在系統(tǒng)發(fā)生樹還是在晶體結(jié)構(gòu)上都具有明顯的差異。因此有可能針對BaDRL篩選一批抗菌譜窄、特異性強(qiáng)的抗菌化合物。
　　內(nèi)容:本文首先成功構(gòu)建了E.coli BL21(DE3)-BaDRL工程菌株，對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)布魯桿菌源BaDRL。使用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)

3、時，BaDRL表現(xiàn)出菌體產(chǎn)量低，酶活性不高等問題;通過進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，使用自誘導(dǎo)方式培養(yǎng)不僅解決了菌體產(chǎn)量低的情況而且獲得的酶活力大大增強(qiáng)。其次，以葡萄糖為原料模擬體內(nèi)糖酵解途徑，采用“一鍋法”酶法合成了純度較高的DRL底物DXP，用于研究BaDRL催化機(jī)制。最后，利用羰基化合物中的羰基與溶劑H2O交換氧原子這一現(xiàn)象，在H218O中進(jìn)行DRL催化DXP向MEP轉(zhuǎn)化的反應(yīng)，通過分析產(chǎn)物MEP的18O標(biāo)記位置和相對豐度，推測酶BaDRL