Sulfolobus solfataricus P2中（+）-γ-內(nèi)酰胺酶的半理性設(shè)計及其結(jié)構(gòu)改造.pdf

1、(+)-γ-內(nèi)酰胺酶能夠特異性水解外消旋化合物γ-內(nèi)酰胺，生成單一構(gòu)型的(-)-γ-內(nèi)酰胺。來源于Sulfolobus solfataricus P2(SSOP2)中的(+)-γ-內(nèi)酰胺酶具有高穩(wěn)定性和高選擇性，是理想的生物催化劑。本課題通過定點飽和突變與高通量顯色相結(jié)合的方法對酶結(jié)構(gòu)進行改造，進一步提高了酶的催化活性，使其具有更高的工業(yè)應用價值。
　　由于SSOP2中的(+)-γ-內(nèi)酰胺酶目前尚無晶型結(jié)構(gòu)報道，我們通過同源建模、

2、底物對接、動力學分析等進行分子模擬，并根據(jù)氨基酸的空間關(guān)系，分成三個階段選取突變熱點。(1)與催化三聯(lián)體距離處于同一個螺旋或折疊的氨基酸:Ser181、Tyr183、Cys184、Ser110、Thr140、Ser175;(2)計算機模擬關(guān)鍵距離和能量有減小的氨基酸:Ser110、Ile336;(3)與Phe146空間距離較近的氨基酸:Val383、Gly387及Ile452。
　　對突變熱點進行飽和突變，經(jīng)過三輪篩選，最終得到對

3、活性提高有影響的關(guān)鍵位點Ile336、Val383，其中Ile336位點起到了重要的作用，突變體I336R、I336H活性最高，比酶活分別為1249.43U·mg-1和893.48U·mg-1，相對于WT(205.87U·mg-1)活性提高6.07倍和4.34倍。Val383位點中突變體V383N、V383Q對活性的促進作用較強。
　　與實驗室先前研究發(fā)現(xiàn)的V203N、Y388H兩個陽性突變體進行組合構(gòu)建多突變體，得到V203N/

4、Y388H/I336R/V383N及Y388H/I336R/V383N活性相對于WT分別提高了5.01倍和5.25倍，雙突變體Y388H/I336R(2839.36U·mg-1)提高了13.79倍，V203N/I336R(3026.29U·mg-1)提高了14.70倍，三突變體V203N/Y388H/I336R(3304.01U·mg-1)活性最高，相對于WT提高了16.05倍，催化效率Kcat/Km提高了12.52倍。對陽性突變體的結(jié)