新型廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和活性評(píng)價(jià).pdf

1、β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上最主要的抗菌藥物，它能夠作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins,PBPs），阻礙細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖的合成，由于缺乏完整的細(xì)胞壁，在滲透壓的作用下，細(xì)菌不能維持正常的形態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡，而達(dá)到殺菌的目的。但是，自從青霉素在臨床上運(yùn)用以來，迫于生存壓力，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，其中最主要的耐藥機(jī)制就是產(chǎn)生能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶（β-l

2、actamase enzymes）。隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的種類增加，β-內(nèi)酰胺酶的種類也在不斷增多，并且在新的抗生素上市不久后就會(huì)出現(xiàn)能夠水解該類抗生素的酶。
　　根據(jù)Ambler分類法，β-內(nèi)酰胺酶被分為A、B、C、D四類，其中，由于A、C、D類酶的活性位點(diǎn)都有活性絲氨酸殘基，又將它們稱為絲氨酸酶。而B類酶的活性位點(diǎn)含有一個(gè)或兩個(gè)金屬鋅離子，故也稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶。目前，擁有多種耐藥機(jī)制和能夠表達(dá)多種β-內(nèi)酰酶的多重耐藥菌（

3、multiple resistance bacteria，MDR）是臨床上最具威脅性的致病菌。
　　為了克服β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性問題，人們將β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組成復(fù)方制劑使用，極大地提高了β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺酶作用時(shí)，首先形成Michaelis復(fù)合物，然后酶活性位點(diǎn)處的絲氨酸殘基對(duì)β-內(nèi)酰環(huán)上的羰基進(jìn)行親核進(jìn)攻，使內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵斷裂，形成酶-底物共價(jià)化合物，使酶處于抑制

4、狀態(tài)。目前，市場(chǎng)上的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑主要有克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦，它們都含有與β-內(nèi)酰胺類抗生素相似的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)。但是，克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦只對(duì) A類絲氨酸酶有效，對(duì)B、C、D類酶基本沒有抑制效果，面對(duì)種類不斷增多的廣譜酶和多重耐藥菌，現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑根本無法滿足臨床的需求。
　　阿維巴坦（Avibactam），屬于二氮雜二環(huán)辛烷類化合物。2015年2月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)由阿特維斯（Actavis）與阿斯利

5、康（AZN）聯(lián)合研發(fā)的新型復(fù)方制劑抗生素藥Avycaz（ceftazidime-avibactam，頭孢他啶-阿維巴坦）在美國(guó)上市，主要用于治療成人復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染(cIAI)及復(fù)雜性尿路感染(cUTI)，同時(shí)也適用于治療方案有限或無替代治療方案的腎臟感染(腎盂腎炎)患者。與經(jīng)典的“自殺式酶抑制劑”相比，阿維巴坦與酶的作用機(jī)制有其獨(dú)特的優(yōu)越性：在絲氨酸酶的親核進(jìn)攻下，阿維巴坦酰胺鍵斷裂，開環(huán)形成酶-抑制劑共價(jià)化合物，使酶處于抑制狀態(tài)，且

6、不發(fā)生水解，再經(jīng)環(huán)化恢復(fù)β-內(nèi)酰胺環(huán)，重新得到具有抑酶活性的阿維巴坦。開環(huán)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合環(huán)速率，使酶基本處于抑制狀態(tài)。由于阿維巴坦的結(jié)構(gòu)能恢復(fù)，故具有長(zhǎng)效性。阿維巴坦的出現(xiàn)，打破了30多年來無新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑可用的局面，由于阿維巴坦對(duì) A、C類酶和部分 D類酶都具有抑制作用，對(duì)未來研發(fā)具有更廣譜的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑開辟了新的道路，但是到目前為止仍然沒有對(duì)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶和大部分D類酶起作用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。
　　本文

7、以阿維巴坦作為先導(dǎo)化合物，基于初步建立的構(gòu)效關(guān)系以及對(duì)酶-抑制劑晶體復(fù)合物的空間構(gòu)象和作用機(jī)制分析，設(shè)計(jì)了兩類具有二氮雜二環(huán)辛烷結(jié)構(gòu)并且保持陽性化合物原有構(gòu)型的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，期望得到抑酶活性更好并且更具廣譜性的新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。
　　本文對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的阿維巴坦合成工藝進(jìn)行了改造和優(yōu)化。以(S)-1-(芐氧羰基)-5-氧代吡咯烷-2-羧酸為起始原料，經(jīng)過13步反應(yīng)得到阿維巴坦的鈉鹽。將文獻(xiàn)中的反應(yīng)從15步縮短為13步；文獻(xiàn)

8、中所有反應(yīng)產(chǎn)物采用硅膠柱層析法分離純化，本文大部分采用重結(jié)晶方法替代；本文還對(duì)反應(yīng)過程中的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和確定，使反應(yīng)具備可控性和可重復(fù)性。阿維巴坦的光學(xué)純度和化學(xué)純度經(jīng)過HPLC檢測(cè)，而Na+含量還經(jīng)過Agilent ICP-MS測(cè)定，并且建立了有效的阿維巴坦化學(xué)純度和光學(xué)純度的檢測(cè)方法。改進(jìn)后的工藝具有合成路線相對(duì)較短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且收率比原文獻(xiàn)提高了兩倍，為進(jìn)一步研發(fā)適合工業(yè)生產(chǎn)阿維巴坦的工藝路線奠定了重要基礎(chǔ)。
　　參

9、照阿維巴坦的合成工藝路線，本文合成了目標(biāo)化合物的關(guān)鍵中間體（2S，5R）-6-（芐氧基）-7-氧代-1，6-二氮雜環(huán)[3.2.1]辛烷-2-羧酸，在關(guān)鍵中間體的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了兩類目標(biāo)化合物，總共合成19個(gè)新結(jié)構(gòu)目標(biāo)化合物，所有合成的中間體和目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)都經(jīng)過ESI-MS和1H-NMR確認(rèn)。
　　目前，已經(jīng)對(duì)包括陽性化合物阿維巴坦在內(nèi)的20個(gè)化合物進(jìn)行了初步的生物活性評(píng)價(jià)。首先對(duì)酶進(jìn)行了滴定實(shí)驗(yàn)，然后將待檢測(cè)目標(biāo)化合物配成12個(gè)

10、濃度梯度，分別與Class A類TEM-1、Class C類AmpC和Class D類OXA-23酶發(fā)生作用。以頭孢硝噻為底物，加入到酶與目標(biāo)化合物的混合物中，通過檢測(cè)混合物的吸光度，確定底物的含量，從而得出目標(biāo)化合物對(duì)酶的抑制率，以目標(biāo)化合物的IC50值來表示抑酶活性大小。
　　通過生物活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，R2基為芐氧基取代的第Ⅰ類目標(biāo)化合物 IC50值普遍較高（>10000nM）；而保留先導(dǎo)化合物中的磺酸酯基，對(duì)R1進(jìn)行改造得到

11、的第Ⅱ類目標(biāo)化合物IC50值較低，具有較好的抑酶活性，特別是R1基為飽和脂肪鏈烴取代的目標(biāo)化合物。其中化合物L(fēng)13、L14、L15和L19，同時(shí)對(duì)Class A類酶TEM-1和Class C類酶AmpC的IC50值都小于10nM，優(yōu)于陽性化合物阿維巴坦，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
　　根據(jù)活性篩選結(jié)果，本文對(duì)所合成的新目標(biāo)化合物進(jìn)行了初步的構(gòu)效關(guān)系分析：當(dāng)R1為4～5個(gè)C的飽和脂肪鏈烷烴，R2為磺酸酯基時(shí)，對(duì)A、C類酶的抑制活性較好；