攜帶β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌的耐藥分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　腸桿菌科細(xì)菌尤其大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是醫(yī)院和社區(qū)感染的常見(jiàn)病原體，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是治療腸桿菌科細(xì)菌感染的最常用藥物。不同國(guó)家和地區(qū)的β-內(nèi)酰胺耐藥菌株的流行特征往往有較大差異，研究這些菌株的臨床特點(diǎn)和耐藥分子機(jī)制，對(duì)醫(yī)院感染控制有重要的意義。
　　目的：
　　深入研究我院β-內(nèi)酰胺耐藥腸桿菌科細(xì)菌的臨床特點(diǎn)和耐藥分子機(jī)制，為臨床相關(guān)疾病的抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　收集20

2、10-2015年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床腸桿菌科細(xì)菌，用SPSS軟件對(duì)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用多重PCR法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因和質(zhì)粒類(lèi)型。使用雙紙片協(xié)同試驗(yàn)測(cè)定肺炎克雷伯菌KP01的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)表型，用多重PCR法確定KP01攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因，用細(xì)菌接合試驗(yàn)和電擊轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。使用生物細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行肺炎克雷伯菌KP01和大腸埃希菌HX43的DNA提取，并用Illumina Miseq

3、高通量測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。使用Edena、RAST、ResFinder、PlasmidFinder、MLST和NCBI Blast等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　2010-2015年間共收集5829株腸桿菌科細(xì)菌，其中4474株(76.8％)為β-內(nèi)酰胺耐藥菌，主要分離自尿液(50.8％)和痰液(20.9％)，病區(qū)來(lái)源主要為泌尿外科(27.6％)和重癥病區(qū)(11.9％)，細(xì)菌種屬以大腸埃希菌(45.5％)和肺炎克雷

4、伯菌(35.6％)為主。這些菌株對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南和厄他培南的敏感率分別為0％、36.7％、71.9％、96.4％和95.2％，對(duì)非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素也呈現(xiàn)不同程度的耐藥。β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)顯示blaTEM、blaCTX-M和blaSHV為主要的β-內(nèi)酰胺酶基因型，質(zhì)粒分型則以IncF為主。
　　肺炎克雷伯菌KP01分離自一位老年重癥肺炎患者，呈現(xiàn)對(duì)多種藥物的耐藥性，PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其同時(shí)攜帶blaCTX-M

5、-24、blaSHV-11和blaGES-5β-內(nèi)酰胺酶基因。這是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)攜帶blaGES-5的腸桿菌科細(xì)菌。blaGES-5基因只能通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)blaGES-5基因定位在不可接合的質(zhì)粒上。攜帶blaGES-5的轉(zhuǎn)化子對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的MIC值顯著提高。高通量測(cè)序獲得覆蓋度為167.7倍的測(cè)序深度，數(shù)據(jù)拼接后獲得500 bp以上contig共99條。耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)KP01攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因3個(gè)（blaGES-

6、5，blaSHV-11和blaCTX-M-24），氨基糖苷類(lèi)耐藥基因3個(gè)(aadA2，strA和strB)，磺胺類(lèi)耐藥基因1個(gè)(sul2)，甲氧芐啶耐藥基因1個(gè)（dfrA12），四環(huán)素耐藥基因有1個(gè)(tetA)。MLST分析發(fā)現(xiàn)KP01屬于ST895。blaGES-5被發(fā)現(xiàn)定位于一個(gè)約28.5 kb的質(zhì)粒pGES-GZ上，該質(zhì)粒的復(fù)制相關(guān)基因與非發(fā)酵菌質(zhì)粒有高度同源性(99％)。對(duì)blaGES-5基因環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)它定位于一個(gè)新型的1類(lèi)整

7、合子中，該整合子缺乏3'保守區(qū)域(3'CS)結(jié)構(gòu)，攜帶blaGES-5和兩個(gè)序列完全一致的orf28基因。
　　大腸埃希菌HX43分離自一位兒科重癥肺炎患者，該菌株除對(duì)碳青霉烯類(lèi)敏感外，對(duì)其他臨床抗生素均耐藥。高通量測(cè)序獲得覆蓋度為142倍的測(cè)序深度，數(shù)據(jù)拼接后獲得500 bp以上contig共169條。耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)多種抗生素耐藥基因，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)(blaCMY-42，blaCTX-M-14和blaOXA-30)、氨基糖苷

8、類(lèi)(aac(3)-Ⅱa，aadA5，strA，strB和aac(6')-Ⅰb-cr)、喹諾酮類(lèi)(aac(6')-Ⅰb-cr)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(erm(B)和mph(A))、氯霉素類(lèi)（catB3和cmlA1）、磺胺類(lèi)（sul1和sul2）、甲氧芐啶類(lèi)（dfrA17）和四環(huán)素類(lèi)(tet(B))的耐藥基因。blaCMY-42為國(guó)內(nèi)少見(jiàn)的基因亞型，位于一個(gè)截短的ISEcp1元件下方，其下游則為編碼外膜脂蛋白的blc基因和消毒劑耐藥基因sugE。質(zhì)粒