疏水電荷誘導(dǎo)置換色譜-方法學(xué)建立和置換劑篩選.pdf

1、置換色譜是一種高通量、高分辨率的色譜分離方法,其基本原理是采用一種與固定相親和力強于所有目標(biāo)溶質(zhì)的物質(zhì)(置換劑)將吸附在色譜柱上的目標(biāo)溶質(zhì)置換下來,從而實現(xiàn)分離。但是,由于在機理和應(yīng)用方面的一些困難,目前置換色譜在生物分離過程中的應(yīng)用相對較少。本文以置換色譜為核心,針對限制其發(fā)展應(yīng)用的一系列問題展開研究,以期推動置換色譜在生物分離過程中的應(yīng)用。
　　 本文首先提出了“疏水電荷誘導(dǎo)置換色譜”這一新型分離方法,以解決傳統(tǒng)置換色譜中色

2、譜柱再生困難的問題。疏水電荷誘導(dǎo)置換色譜采用具有適當(dāng)解離性質(zhì)的疏水性分子作為固定相配基,吸附和置換過程通過疏水相互作用進(jìn)行。置換完成后調(diào)節(jié)pH值使配基和置換劑帶上同種電荷而產(chǎn)生靜電排斥,從而使置換劑洗脫而實現(xiàn)色譜柱的再生。采用氯化芐乙氧銨作為置換劑,疏水電荷誘導(dǎo)介質(zhì)MEP Hypercel作為固定相,在pH5.0的條件下成功實現(xiàn)了溶菌酶和α-胰凝乳蛋白酶原A的分離,其收率和純度與其他形式的置換色譜相當(dāng)。利用低pH值下置換劑和配基之間的靜

3、電排斥作用實現(xiàn)了色譜柱的高效再生,其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)再生方法。
　　 針對置換色譜中置換劑選擇困難這一問題,本文開發(fā)了置換劑-固定化配基對接的方法進(jìn)行置換劑的虛擬篩選。采用文獻(xiàn)中陽離子置換劑、陰離子置換劑和疏水置換劑的實驗數(shù)據(jù)對該方法進(jìn)行驗證,計算結(jié)果和實驗結(jié)果吻合較好,Spearman排序相關(guān)系數(shù)均在0.5以上,表明該方法用于置換劑篩選是可行的。以新型疏水電荷誘導(dǎo)介質(zhì)5-Aminoindole Superose為目標(biāo)介質(zhì),采用

4、該方法從1000余種現(xiàn)有化合物中篩選出了多種置換劑,這些置換劑均未見文獻(xiàn)報道。置換色譜實驗表明,篩選出的置換劑具有良好的置換性能。
　　 置換色譜的微觀機理對其過程設(shè)計和優(yōu)化具有重要意義,但目前此方面的研究還未見文獻(xiàn)報道。本文采用共聚焦激光掃描顯微鏡對置換色譜的微觀機理進(jìn)行了初步研究。采用熒光標(biāo)記的蛋白和具有適當(dāng)熒光性能的置換劑實現(xiàn)了置換色譜過程的可視化觀察。結(jié)果表明,置換色譜中,小分子置換劑的傳質(zhì)速率較快,而蛋白脫附過程則是置