多通道流式細(xì)胞分析系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、多通道流式細(xì)胞分析系統(tǒng)對(duì)懸液中處于高速、直線流動(dòng)的單細(xì)胞或其他微粒的散射光信號(hào)和（或）熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高速、逐一、多參數(shù)的定量分析。多通道流式細(xì)胞分析系統(tǒng)作為一種高通量單細(xì)胞臨床檢驗(yàn)分析儀器，在細(xì)胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生殖學(xué)、制藥學(xué)、免疫學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床疾病檢驗(yàn)等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。目前多通道流式細(xì)胞分析系統(tǒng)的關(guān)鍵技術(shù)主要由國(guó)外幾家公司把持，對(duì)各功能模塊中關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行理論及工程實(shí)現(xiàn)方面的研究具有重大意義。另外，

2、在流動(dòng)室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、核流流速穩(wěn)定性評(píng)估、基于散射光的細(xì)胞預(yù)分群、流式熒光壽命測(cè)量以及熒光補(bǔ)償?shù)确矫嫒孕枰黄啤?br>　　本文以多通道流式細(xì)胞分析系統(tǒng)中層流形成、激發(fā)光光斑整形、散射光激發(fā)及收集檢測(cè)、多色熒光分光收集、光電轉(zhuǎn)換、電信號(hào)處理、數(shù)據(jù)傳輸及軟件分析等處理過程為技術(shù)牽引，針對(duì)常規(guī)分析型流式細(xì)胞分析系統(tǒng)的氣液路模塊、光路模塊、電子電路模塊和軟件分析模塊中的關(guān)鍵技術(shù)問題，面向工程應(yīng)用，通過研究核流寬度及流速穩(wěn)定性評(píng)估方法、光斑整形方法

3、及光強(qiáng)分布特性、散射光檢測(cè)方法、熒光補(bǔ)償算法及脈沖表征方法，確定流式細(xì)胞分析系統(tǒng)測(cè)量過程中主要誤差來源，據(jù)此提出一系列優(yōu)化方法減小測(cè)量誤差并提高測(cè)量穩(wěn)定性。完成的主要研究工作和成果總結(jié)如下:
　　1)針對(duì)單鞘液入口流動(dòng)室結(jié)構(gòu)存在樣本液兩側(cè)壓力不一致導(dǎo)致核流寬度不穩(wěn)定的問題，設(shè)計(jì)了一種雙鞘液進(jìn)樣流動(dòng)室結(jié)構(gòu)。分別對(duì)0°、60°及90°雙鞘液入口結(jié)構(gòu)進(jìn)行了聚焦效果仿真及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;對(duì)雙鞘液平行進(jìn)樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以實(shí)現(xiàn)核流寬度的穩(wěn)定

4、、可控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低速、中速、高速的核流寬度平均值分別為8.38μm(最大誤差1.42μm，標(biāo)準(zhǔn)差0.70μm)、13.73μm（最大誤差1.27μm，標(biāo)準(zhǔn)差0.71μm）、20.11μm（最大誤差1.09μm，標(biāo)準(zhǔn)差0.59μm）。
　　2)針對(duì)流動(dòng)室內(nèi)微流道空間狹小，無法直接對(duì)核流寬度及流速穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估的問題，提出基于圖像分析的核流穩(wěn)定性評(píng)估方法。對(duì)核流顯微圖像進(jìn)行分析，提出基于一階導(dǎo)數(shù)極值點(diǎn)的核流寬度判定方法對(duì)核流寬度穩(wěn)

5、定性進(jìn)行評(píng)估;利用高速相機(jī)對(duì)微球拖尾圖像進(jìn)行采集，實(shí)現(xiàn)對(duì)核流流速穩(wěn)定性評(píng)估，并搭建了實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，分別利用4種粒徑標(biāo)準(zhǔn)微球在3種流速下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　3)針對(duì)前向散射光單片檢測(cè)方法無法實(shí)現(xiàn)粒徑及折射率有效識(shí)別的問題，提出了一種基于陣列光電探測(cè)的前向散射光檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了前向散射光角度分布特性的準(zhǔn)確聚類。搭建了陣列探測(cè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，并利用4種粒徑、4種折射率的標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)不同折射率微球的最大聚類誤差為4.51％，對(duì)不同粒

6、徑微球的最大聚類誤差為2.55％。
　　4)針對(duì)熒光壽命時(shí)域及頻域測(cè)量系統(tǒng)成本高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的問題，根據(jù)流式脈沖信號(hào)特性，提出了一種基于熒光脈沖時(shí)延估計(jì)結(jié)合硬件系統(tǒng)時(shí)延標(biāo)定的熒光壽命檢測(cè)方法。利用一種基于互相關(guān)算法的高精度時(shí)延估計(jì)算法對(duì)熒光脈沖與散射光脈沖之間的時(shí)延進(jìn)行測(cè)量，并將時(shí)延估計(jì)結(jié)果與高斯擬合結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，對(duì)該方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證;搭建了流式熒光壽命檢測(cè)系統(tǒng)，并利用CD3-FITC，CD8-PE及CD4-PC5三種熒光染料進(jìn)