不同特性納米銀制備及遺傳毒性定量研究.pdf

1、納米技術的研究熱潮遍布世界各國，納米銀的應用前景也不斷被挖掘。納米銀擁有獨特的抗菌作用，使其大量應用于日常用品領域、工業(yè)領域和生物醫(yī)學領域。然而研究表明，納米銀能穿透細胞膜進入細胞中，甚至進入細胞核中，可能會引起細胞核內物質形態(tài)結構和功能的改變，誘導染色體畸變、DNA損傷和基因突變。廣泛的應用使納米銀在各個方面接觸人體，并可能與體內不同組織、細胞或生物分子產生相互作用。體內研究表明，納米銀能達到動物骨髓細胞和臟器中，并且停止暴露后能滯留

2、在動物臟器中。評估納米銀對生物的毒性效應至關重要，尤其是與致癌、致畸、致突變相關的遺傳毒性效應。
　　本研究首先制備出三種不同粒徑的PVP包被納米銀。然后選擇所制備納米銀中分散性良好且粒徑分布集中的納米銀與市場上購買的兩種納米銀一起進行遺傳毒性定量評價。根據(jù)OECD用于檢測遺傳毒性致癌物的體內外遺傳毒性試驗的推薦，再結合納米銀本身特殊性質選擇合適試驗方法，采取體外彗星實驗和胞質阻滯微核組學試驗與體內小鼠骨髓微核試驗形成組合試驗方案

3、，全面考察不同特性納米銀的遺傳毒性。對于納米銀體外遺傳毒性研究，本研究選取人肝癌細胞（HepG2）作為體外評價模型，分別利用Hoechst-33258染色、彗星實驗、胞質阻滯微核組學試驗定量研究了三種不同特性納米銀(20nmAgNPs，20nmPVP-AgNPs，40nmPVP-AgNPs)染毒的HepG2細胞核形態(tài)與凋亡率、DNA損傷、染色體畸變等情況。接著使用20nmPVP-AgNPs染毒人肝癌細胞(Hep G2)和人肺癌細胞(A5

4、49)24h和48h后進行微核實驗，比較納米銀對不同細胞遺傳毒性效應的差異。用20nmPVP-AgNPs染毒HepG2細胞24h比較胞質阻滯微核微核組學試驗和微核實驗結果差異。對于納米銀體內遺傳毒性研究，開展了兩種不同包被納米銀(20nm AgNPs，20nm PVP-AgNPs)對小鼠經口給藥28天后骨髓微核試驗，并考察了小鼠體重變化和骨髓微核率等指標的改變。最后選取人肝癌(HepG2)細胞作為評價模型，運用彗星實驗與胞質阻滯微核組學

5、試驗，研究了市場中某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑的遺傳毒性效應。得出的主要結果如下:
　　(1)不同特性納米銀制備及表征結果。使用馬爾文粒度儀測得制備所得平均水合粒徑94.84nm、111.1nm、120.7nm的PVP包被納米銀。使用TEM觀察自行制備的納米銀顆粒和兩種市場購買的納米銀顆粒，三種納米銀顆粒平均粒徑分別為39.50±9.09nm、19.95±4.75nm和18.29±5.50nm。
　　(2)體外遺傳毒性研究結

6、果。在相同染毒條件下，三種不同特性納米銀在各個濃度凋亡率均是:20nmPVP-AgNPs＞20nmAgNPs＞40nmPVP-AgNPs。在所有處理組實驗劑量下凋亡率均在10.33％以下。研究發(fā)現(xiàn)三種納米銀均可以引起HepG2細胞DNA損傷增加，但是不同特性納米銀對細胞DNA損傷影響具有差異。和對照組比較，染毒24h后20nmAgNPs組和40nmPVP-AgNPs組中濃度在20μg/mL的Olive尾矩與尾長改變無統(tǒng)計學意義，20nm

7、PVP-AgNPs組20μg/mL的DNA百分比改變無統(tǒng)計學意義，而其余各劑量組各指標都反應HepG2細胞DNA損傷程度都增加。三種納米銀使HepG2細胞DNA損傷程度:20nmAgNPs＞20nmPVP-AgNPs＞40nmPVP-AgNPs。
　　胞質阻滯微核組學試驗研究表明，除核質橋外，三種材料的各效應指標均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢。說明本實驗采用的三種不同特性納米銀材料均對HepG2細胞染色體丟失、染色體斷裂、基因擴增

8、與基因量的改變效應呈濃度相關性。三種材料在相同染毒濃度時，總微核數(shù)、Ⅰ型微核數(shù)、Ⅱ型微核數(shù)、核芽數(shù)均是20nmPVP-AgNPs＞20nmAgNPs＞40nmPVP-AgNPs。說明在相同包被下，小粒徑納米銀更容易誘發(fā)HepG2細胞染色體畸變等相關效應;在相同粒徑下，PVP包被納米銀比未包被納米銀更容易誘發(fā)HepG2細胞染色體畸變等相關效應。
　　兩種不同方法對比研究結果。微核試驗研究表明不同濃度20nm PVP-AgNPs染毒A

9、549細胞和HepG2細胞24h、48h后，兩株細胞的兩種染毒時間內均呈濃度-效應關系。在劑量小于等于80μg/mL時，兩株細胞各濃度微核數(shù)均是染毒后24h大于染毒48h，而在劑量為160μg/mL時，兩株細胞在染毒48h后的微核數(shù)大于24h。在染毒24h時，40～160μg/mL的A549細胞和20～160μg/mL劑量范圍內的HepG2細胞微核數(shù)變化均出現(xiàn)顯著性差異，說明在納米銀染毒24h時HepG2細胞微核數(shù)變化敏感度高于A549

10、細胞。比較用胞質阻滯微核微核組學試驗和微核實驗分別檢測20nmPVP-AgNPs染毒HepG2細胞24h在20～160μg/mL劑量范圍內都呈現(xiàn)陽性結果。結果表明胞質阻滯微核組學試驗表現(xiàn)出比微核試驗檢測出更多的微核率。提示納米銀的遺傳毒性沒有受細胞松弛素B影響而減弱遺傳毒性效應。說明相比于傳統(tǒng)的微核實驗，胞質阻滯微核組學試驗是一種可以用作測定納米銀遺傳毒性的全面而靈敏的實驗;HepG2細胞株適宜作為胞質阻滯微核組學試驗體外評估納米銀的模

11、型。
　　(3)體內遺傳毒性研究結果。不同包被納米銀小鼠骨髓微核試驗研究表明，20nmAgNPs組在本試驗設計劑量50mg/kg內在灌胃28天內對小鼠體質量無明顯影響。20nmPVP-AgNPs組劑量10mg/kg內在灌胃28天內對小鼠體質量無明顯影響。不同包被納米銀引起小鼠骨髓微核率改變結果表明，20nm無包被納米銀在50mg/kg劑量內和灌胃28天內對小鼠骨髓微核率無明顯影響。20nmPVP-AgNPs劑量10mg/kg內在灌

12、胃28d內對小鼠骨髓微核率無明顯影響。本實驗發(fā)現(xiàn)在高劑量250mg/kg下，納米銀能導致小鼠體內細胞產生染色體畸變效應。20nmPVP-AgNPs對小鼠體重和骨髓微核率影響均大于20nm無包被納米銀。
　　(4)選取人肝癌(HepG2)細胞作為評價模型，運用彗星實驗與胞質阻滯微核組學試驗，研究了市場中某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑的遺傳毒性效應結果。超微量微孔板分光光度計檢測某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑結果顯示未出現(xiàn)納米銀顆粒特征吸

13、收峰，而馬爾文粒徑分析儀檢測結果顯示有顆粒特征吸收峰的出現(xiàn)，考慮到是由該分散劑中有膠體顆粒團聚或者存在的極微量納米銀顆粒存在造成的。由此得出“某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑”中銀的成分可能主要為銀離子膠團。彗星實驗和胞質阻滯微核組學試驗測定分散劑對HepG2細胞遺傳毒性結果表明，Olive尾矩、尾長、尾部DNA百分比和Ⅱ型微核數(shù)均在0.125μg/mL和0.25μg/mL時與空白對照組有差異。說明在0.125μg/mL和0.25μg/mL

14、劑量下某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑可能引起HepG2細胞DNA和染色體丟失。
　　綜上所述，本研究探討了不同特性納米銀體內外遺傳毒性差異，包括DNA損傷、染色體丟失、染色體斷裂、基因擴增與基因量的改變等效應。結果表明相同粒徑下，無包被納米銀比PVP包被納米銀更容易引起DNA損傷，PVP包被納米銀比無包被納米銀更容易引起細胞和動物染色體畸變相關效應。體外遺傳毒性實驗彗星實驗和胞質阻滯微核組學試驗表明，在相同包被下，小粒徑納米銀比大粒

15、徑納米銀更容易誘發(fā)HepG2細胞產生DNA損傷、染色體丟失、染色體斷裂、基因擴增與基因量的改變。體外微核試驗和體內微核實驗之間在不同特性納米銀遺傳毒性強弱方面有良好相關性。胞質阻滯微核組學試驗和微核實驗測定納米銀引起HepG2細胞染色體畸變效應差異比較結果表明相比于傳統(tǒng)的微核實驗，胞質阻滯微核組學試驗是一種可以用作測定納米銀遺傳毒性的全面而靈敏的試驗。由彗星實驗與胞質阻滯微核組學試驗結合，利用HepG2細胞作為體外評價模型，能方便快速檢