煙草煙堿含量的全基因組關聯(lián)分析及其候選基因預測.pdf

1、煙堿是煙草重要的品質性狀，明確煙堿含量的調控機制，篩選特異煙堿含量的煙草品種，對提高煙葉品質具有重要的指導意義。然而，直接鑒定煙草種質資源的煙堿含量周期很長、效率偏低、消耗大量人力物力，影響了種質資源的發(fā)掘利用。而利用分子標記開展特異煙堿種質的篩選，則能夠有效縮短鑒定周期，節(jié)約成本，極大提高工作效率。近年來，雖有一些煙堿相關分子標記挖掘工作得以開展，但限于分子標記密度不高、準確度不夠等問題，煙堿相關分子標記很少被應用到種質資源的篩選上。

2、而隨著二代高通量測序技術的快速發(fā)展，RAD測序技術因其所具有的基因組覆蓋均勻、成本低、周期短等特點，得到了廣泛的應用。同時，得益于高通量測序技術的發(fā)展，依賴于SNP標記的全基因組關聯(lián)分析方法迅速發(fā)展為植物復雜數(shù)量遺傳性狀研究的有效手段。
　　本研究對219份烤煙品種開展了RAD重測序，對29份烤煙品種開展全基因組重測序，結合全基因組關聯(lián)分析的方法，發(fā)掘與煙堿含量變異、煙堿合成關鍵基因表達量顯著關聯(lián)的SNP位點;同時針對關聯(lián)位點進行

3、相應候選基因的預測，功能標記開發(fā)等工作，對煙草煙堿相關分子標記挖掘，高煙堿品種選育等工作具有重要的指導意義。具體研究結果如下:
　　1.對219份烤煙品種進行了RAD重測序，獲得了384，904個高質量SNP位點的群體分型數(shù)據(jù)，結合8個年點烤后煙葉煙堿含量表型鑒定，運用全基因組關聯(lián)分析的方法，在顯著性閾值之上共發(fā)掘到2個與煙堿含量顯著關聯(lián)的SNP位點，分別位于1號染色體的69，912，063 bp處和2號染色體的81，115，79

4、4 bp處。針對關聯(lián)位點，基于煙草基因組數(shù)據(jù)庫，預測到2個候選基因，分別是Ntab0691660和Ntab0574860。候選基因Ntab0691660與擬南芥ATCYS6基因同源，推測Ntab0691660可能通過調控生物脅迫抗受能力相關通路參與了煙堿合成代謝的調控;候選基因Ntab0574860與水稻中的OSJMJ706基因同源，推測Ntab0574860可能與煙堿合成關鍵酶腐胺N-甲基轉移酶相關基因的表達調控有關。對關聯(lián)分析挖掘到

5、的SNP位點設計了相應的等位變異特異PCR(AS-PCR)標記，關聯(lián)位點C1_69，912，063篩選到1個可用的標記AP014，SNP位點C2_81，134，669緊鄰關聯(lián)位點C2_81，115，794，從該位點上篩選到2組擴增帶型清晰的AS-PCR標記:AP068和AP072。研究為高煙堿優(yōu)異等位基因型的發(fā)掘和高煙堿新品種的分子標記輔助選擇提供了可用的標記和基因資源。
　　2.對29份烤煙品種開展了全基因組重測序，基于所揭示的

6、基因組序列變異，分析了普通煙草種4個PMT基因家族基因的SNP和Indel變異，篩選錯義突變位點。在基因Ntab0153810(NtPMT2)的第1個外顯子內第75個核苷酸位置上的SNP(C23_49502707)發(fā)現(xiàn)一個錯義突變。與參考基因組紅花大金元相比，該SNP在部分品種上由T突變?yōu)镚，從而導致翻譯后的氨基酸序列由組氨酸(H/His)變?yōu)楣劝滨０?Q/Gln)，其氨基酸性質從堿性氨基酸變?yōu)轷０奉惏被帷７讲罘治鼋Y果表明，在顯著水平

7、上T基因型比G基因型供試品種的煙堿平均含量高14.7％，T基因型是高煙堿優(yōu)異等位變異。針對該位點，開展了功能標記轉化，篩選到1對擴增穩(wěn)定、帶型清晰的功能標記AP058。本研究為高煙堿品種的分子標記輔助選擇提供了可用的標記和基因資源。
　　3.對219份烤煙品種進行了煙堿合成關鍵基因PMT、QPT的表達量表型鑒定，結合RAD重測序所獲得的高質量SNP數(shù)據(jù)，利用全基因組關聯(lián)分析的方法，在顯著性閾值之上挖掘到2個與PMT表達量相關的SN

8、P位點，分別位于2號染色體的76585016 bp處和5號染色體的150848920 bp處;8個與QPT表達量顯著相關的關聯(lián)SNP位點，分別位于2號染色體上的2177629bp和2177631 bp處、4號染色體上的150426307bp處以及9號染色體上的15845870bp、107612287bp、107612311bp、107612331bp和107612344bp處。利用水培的方法，在人工氣候培養(yǎng)室內對煙草幼苗進行培養(yǎng)，保證了