煙草基因組中nbs類抗性基因的分析

1、煙草基因組中NBS類抗性基因的分析,專 業(yè) 作 物 學(xué)答 辯 人 冷 曉 東指導(dǎo)教師 樊龍江教授,綜 述,煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草行業(yè)一方面能夠?yàn)閲?guó)家增加稅收，同時(shí)對(duì)發(fā)展國(guó)民經(jīng)濟(jì)和滿足人民生活需要，都起了重大的作用。煙草作為模式植物，對(duì)于植物科學(xué)發(fā)展來(lái)說(shuō)，無(wú)論是在基礎(chǔ)研究還是在應(yīng)用方面都起了很大作用，尤其是在遺傳、育

2、種、生理、生化以及采收后代謝方面。煙草也是研究植物病原互作最好的模式作物之一。抗性基因在植物與病原互作過(guò)程中，起到非常重要的作用。所以對(duì)抗性基因的研究，無(wú)論對(duì)植物本身，還是對(duì)指導(dǎo)育種都有非常重要的意義。在煙草基因組測(cè)序的背景下，我們對(duì)煙草抗性基因進(jìn)行了一些基礎(chǔ)性的研究。,研究過(guò)程,煙草基因組的分析 (基于TGI基因組序列)

3、 NBS類抗性基因的 生物信息學(xué)分析 煙草NBS類抗性基因 遺傳多態(tài)性分析

4、 NBS類抗性 與抗性基因連鎖的 基因家族分析 SSR分子標(biāo)記的開發(fā),,關(guān)于TGI（Tobacco Genome I

5、nitiative http://tgi.ncsu.edu/）,,拼接去冗余后信息,所有數(shù)據(jù)來(lái)源,基因組序列：TGI EST序列：TGI Genebank ESTobacco (European Sequencing of Tobacco Project http://www.

6、estobacco.info/) TAB (Transcriptome Analysis of BY-2， http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/),RGA（ Reistance gene analogue）的背景介紹,,I,II,III,IV,V,,,PK,,,,NBS,LRR,LZ/CC,,TIR,,TM,,PK,Pto,Mi

7、/Prf,Xa21,Cf4/Cf9,N,,NBS,,LRR,,LRR,,LRR,,TM,Representative gene,分析流程,,已知的NBS抗性基因,同源序列搜索,清理拼接,基因預(yù)測(cè),蛋白預(yù)測(cè),尋找結(jié)構(gòu)域,系統(tǒng)發(fā)育樹,已知的NBS類抗性基因,煙草基因組中鑒定出的NBS類基因結(jié)果統(tǒng)計(jì),煙草基因組中30個(gè)NBS類基因的分類,,,煙草和其他植物間NBS類基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,藍(lán)色，綠色，紫色和黃色分別代表煙草，擬南芥，番茄和楊樹

8、,實(shí)驗(yàn)部分,,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,直接測(cè)序,克隆測(cè)序,遺傳多態(tài)性分析,基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析,30對(duì)引物24個(gè)材料,本研究使用的煙草材料,,,注：抗性等信息來(lái)自中國(guó)作物種質(zhì)信息網(wǎng)（http://icgr.caas.net.cn）,引物設(shè)計(jì)位點(diǎn),,植物抗性基因結(jié)構(gòu)和本研究引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)。圖中標(biāo)出了NBS功能域三個(gè)主要基序和C-和N-端通常具有的功能域，箭頭為本研究引物設(shè)計(jì)位點(diǎn),本研究設(shè)計(jì)的30對(duì)煙草RGA引物,,,PCR產(chǎn)物直接測(cè)序鑒定的煙草RG

9、A基因,,得到如下遺傳多態(tài)性分析結(jié)論： 1、栽培與野生煙草之間存在明顯的遺傳多態(tài)性,栽培煙草與其野生祖先種（N.sylvestris）之間的分子多態(tài)性,注：括號(hào)中為累計(jì)長(zhǎng)度（bp）,,2、栽培煙草RGA基因的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)出極端的同質(zhì)性,克隆測(cè)序鑒定的煙草RGA基因家族,HHDJY:紅花大金元,煙草RGA基因亞家族的遺傳分化與進(jìn)化,1 遺傳分化分析 對(duì)11個(gè)RGA家族內(nèi)成員遺傳分

10、化程度進(jìn)行了分析：對(duì)這些 RGA基因家族成員分別進(jìn)行建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)樹型，有些樹分化程度明顯較大（如NBS334），表明這些亞家族內(nèi)部分化明顯。,A,B,C,D,E,F,G,H,基于RGA核苷酸序列和臨接法（NJ）構(gòu)建的煙草RGA基因4個(gè)亞家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹。A: NBS226; B: NBS173; C: NBS271; D: NBS374; E: Nbs359; F: NBS182; G: NBS334; H: NBS267,,2

11、進(jìn)化分析 進(jìn)一步對(duì)RGA亞家族選擇進(jìn)化進(jìn)行分析。RGA基因進(jìn)化歷程可能是處于一種中性隨機(jī)突變狀況（M1a和M7模型）或受到正向或負(fù)向（又稱凈化）的選擇（M2a和M8模型）。根據(jù)Yang等（2005）方法(Yang et al., 2005)，我們可以估計(jì)煙草RGA基因亞家族成員的序列構(gòu)成符合哪個(gè)進(jìn)化模式。結(jié)果表明 在測(cè)驗(yàn)的8個(gè)RGA基因中，大多受到強(qiáng)烈的凈化選擇，同時(shí)部分基因在其個(gè)別位點(diǎn)上受到明顯的正向選擇。,煙草RGA基因

12、亞家族進(jìn)化選擇測(cè)驗(yàn)（似然比）結(jié)果,考慮到測(cè)序等誤差，所選用的每個(gè)RGA亞家族成員間序列差異度≥1% (Couch et al., 2006),煙草基因組RGA基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,通過(guò)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和克隆測(cè)序，共獲得426條特異RGA基因序列，包括來(lái)自栽培煙草11個(gè)RGA家族的293條基因序列和19條野生煙草的基因序列。經(jīng)注釋，除了部分由于移碼、終止子等導(dǎo)致的假基因，其中絕大多數(shù)序列可以獲得完整的NBS蛋白質(zhì)序列。為了確定這些基因序列

13、的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和亞家族歸屬，我們對(duì)獲得的所有序列和已知煙草和其他主要類型抗性基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，我們鑒定的煙草RGA幾乎覆蓋了所以類型的已知抗性類型，包括TIR-NBS類和大量非TIR-NBS類基因。非TIR-NBS類基因中，煙草中一個(gè)煙草亞家族（I2，紅色部分）已進(jìn)行一定數(shù)量的測(cè)序調(diào)查(Couch et al., 2006)，我們獲得的數(shù)據(jù)也同樣包含了這類RGA基因序列。同時(shí)，與已知抗性基因有較大差異的一批煙

14、草RGA被發(fā)現(xiàn)，這部分RGA基因表現(xiàn)出煙草RGA的特異性，其中部分可能是煙草特有的RGA。,基于RGA蛋白質(zhì)序列和臨接法（NJ）構(gòu)建的煙草RGA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹,圖中包括本研究獲得的煙草NBS類抗性基因（黑色）、GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有煙草RGA基因序列（紅色）和目前已克隆抗性基因（其他顏色）。,煙草RGA類抗性基因SSR分子標(biāo)記開發(fā),前期對(duì)煙草RGA基因進(jìn)行了基因組分析，發(fā)現(xiàn)了一大批煙草RGA基因，遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，煙草RGA

15、基因存在高度的遺傳同質(zhì)化，這給發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)RGA增加了難度。為了探索獲得與抗性相關(guān)RGA或相應(yīng)標(biāo)記的高效途徑，本研究利用煙草基因組序列開發(fā)了與RGA緊密連鎖的SSR標(biāo)記。,分子標(biāo)記開發(fā)流程,,在基因組中查找含有RGA區(qū)段的序列,在其上下游尋找SSR序列,設(shè)計(jì)引物,23個(gè)煙草材料中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用于開發(fā)煙草SSR標(biāo)記的23個(gè)栽培煙草品種及其野生種基本信息,注：黑：黑莖?。磺啵呵嗫莶。桓焊Y(jié)線蟲?。籆MV:煙草花葉病毒??；蚜：煙蚜

16、； -：感??；--：中感；---：高感。+：抗病；++：中抗。O：耐病。,開發(fā)煙草中與RGA相關(guān)的SSR標(biāo)記設(shè)計(jì)的引物,,,開發(fā)的與RGA基因相關(guān)的SSR標(biāo)記列表,,討論： 1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在設(shè)計(jì)的43對(duì)引物中，能夠用于 分子標(biāo)記的引物有8對(duì)，NBS連鎖的SSR標(biāo)記的開發(fā) 效率達(dá)到近20%,是一種開發(fā)抗性基因分子標(biāo)記的 有效途徑。 2