基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的Streptococcus thermophilus TF96中心碳代謝機(jī)制的研究.pdf

1、我國(guó)是乳制品消費(fèi)大國(guó)，截止2015年底，我國(guó)酸奶市場(chǎng)銷售額就已經(jīng)突破800億元人民幣，并以每年較高的增長(zhǎng)速度快速增長(zhǎng)。嗜熱鏈球菌是常用的發(fā)酵菌株，市場(chǎng)份額巨大。然而工業(yè)化生產(chǎn)所需的發(fā)酵劑基本依賴于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家企業(yè)。嗜熱鏈球菌細(xì)胞內(nèi)代謝機(jī)制，尤其是碳水化合物代謝的研究，對(duì)優(yōu)化高密度培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵過程參數(shù)的優(yōu)化，以獲得高品質(zhì)的生產(chǎn)發(fā)酵劑具有重要作用。本論文以嗜熱鏈球菌為研究對(duì)象，在化學(xué)合成培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)

2、研究S.thermophilus TF96在控制pH的批次發(fā)酵過程中碳水化合物代謝路徑中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平變化及胞內(nèi)和胞外碳水化合物代謝概況與代謝產(chǎn)物變化，從碳水化合物代謝路徑關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平和代謝產(chǎn)物層面揭示嗜熱鏈球菌碳水化合物代謝及調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)高密度培養(yǎng)奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)共對(duì)遲滯期末期(T1)、對(duì)數(shù)期中期(T2)、對(duì)數(shù)期末期(T3)和穩(wěn)定期(T4)四個(gè)時(shí)期的嗜熱鏈球菌細(xì)胞樣本的RNA進(jìn)行de novo測(cè)序。對(duì)過濾后的reads

3、進(jìn)行組裝，總共組裝得到2255個(gè)Unigene和Contig，平均長(zhǎng)度1119nt，N50達(dá)到2231nt，中位數(shù)長(zhǎng)度達(dá)到1119nt。對(duì)組裝得到的進(jìn)行長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)超過45％的序列長(zhǎng)度不超過500nt。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對(duì)經(jīng)過處理獲得的總Unigene進(jìn)行注釋，其中有1470個(gè)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中。通過分析，注釋到15個(gè)碳水化合物化合物代謝途徑中的基因共有260個(gè)。在S.thermophilusTF96增殖培養(yǎng)過程

4、中共有166個(gè)差異表達(dá)基因跟碳水化合物代謝有關(guān)。碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)是控制菌體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)菌體中編碼乳糖(lacS)、果糖(fruB）、甘露糖(manX/Y)和麥芽糖(malX)等碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的基因都發(fā)生了差異表達(dá)。從總體上看，編碼PTS系統(tǒng)的基因在培養(yǎng)過程中表達(dá)量處于波動(dòng)狀態(tài)，T1和T3是磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因表達(dá)高峰。其中PtsⅠ是磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中關(guān)鍵基因，PtsⅠ表達(dá)量經(jīng)歷不斷下調(diào)之后，當(dāng)菌體到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)顯著上調(diào)1.53倍。la

5、cS是編碼乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，lacS表達(dá)量在T2時(shí)顯著下調(diào)1.8倍，隨后當(dāng)菌體處于T3時(shí)基因轉(zhuǎn)錄水平又顯著上調(diào)，說明遲滯期末期和對(duì)數(shù)期末期是乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)的高峰。受到培養(yǎng)基中乳糖濃度的限制，催化乳糖分解生成葡萄糖和半乳糖的基因lacZ在T4時(shí)顯著下調(diào)超過2倍。半乳糖激酶是嗜熱鏈球菌細(xì)胞中代謝半乳糖的關(guān)鍵蛋白酶，編碼該酶的基因galK表達(dá)水平在穩(wěn)定期之前一直處于上調(diào)狀態(tài)，T3時(shí)的表達(dá)量與T1相比上調(diào)了1.77倍，當(dāng)嗜熱鏈球菌到達(dá)T4時(shí)與T3相比g

6、alK表達(dá)量顯著下調(diào)了2.78倍。從轉(zhuǎn)錄水平來看，S.thermophilus TF96在增殖培養(yǎng)過程中可能具有代謝半乳糖的能力。⑵糖酵解途徑是細(xì)胞中重要的產(chǎn)能途徑。本試驗(yàn)中編碼葡糖激酶基因glk、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因pgi、果糖-二磷酸醛縮酶基因fbaA、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gapA、2，3-二磷酸甘油酸變位酶基因gpmA、丙酮酸激酶基因pyk和碳水化合物分解代謝蛋白基因CcpA等糖酵解途徑基因在增殖培養(yǎng)過程中均發(fā)生了差異表

7、達(dá)。glk和pyk是糖酵解途徑關(guān)鍵基因，其表達(dá)量在整個(gè)生長(zhǎng)過程中都處于下調(diào)狀態(tài)，T2時(shí)下調(diào)的最為顯著。遲滯期末期可能是S.thermophilus TF96糖代謝比較活躍的時(shí)期。此外，遲滯期末期也是pfl、adhE和ackA基因表達(dá)高峰，當(dāng)S.thermophilus TF96到達(dá)T2時(shí)這些基因全都顯著下降，分別下調(diào)了3.44倍、5.57倍、1.79倍和2.76倍，并在此后的培養(yǎng)階段一直都處于低表達(dá)狀態(tài)。丙酮酸氧化酶基因E1.2.3.3

8、在T2時(shí)顯著上調(diào)1.96倍，丙酮酸氧化酶基因的高表達(dá)使得菌體內(nèi)形成乙酰磷酸化池，為指數(shù)期轉(zhuǎn)化為乙酸和提供ATP做好準(zhǔn)備。試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸是丙酮酸最主要的代謝產(chǎn)物，S.thermophilus TF96從T1開始，編碼乳酸脫氫酶的基因表達(dá)量逐漸增加。對(duì)不同時(shí)間段丙酮酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到T4時(shí)，由丙酮酸參與脂肪酸合成的代謝通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平增加。⑶從轉(zhuǎn)錄組水平共檢測(cè)到118個(gè)基因與細(xì)胞膜/壁的生物合成有關(guān)，

9、其中差異表達(dá)基因共有49個(gè)。在S.thermophilus TF96控制pH的批次發(fā)酵過程中，遲滯期是嗜熱鏈球菌有關(guān)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜基因大量表達(dá)的階段，當(dāng)S.thermophilus TF96生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)，大部分基因表達(dá)量開始顯著下調(diào)。編碼轉(zhuǎn)位酶的基因也是肽聚糖合成的關(guān)鍵基因FtsW，基因FtsW表達(dá)量在T2時(shí)顯著上調(diào)了1.6倍，隨后當(dāng)菌體處于T4時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)了1.9倍。本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)錄組水平檢測(cè)到胞壁酸酶、酰胺酶和內(nèi)肽酶與肽聚聚糖降

10、解相關(guān)的酶的基因的表達(dá)。不同肽聚糖水解酶基因在嗜熱鏈球菌增殖培養(yǎng)過程中，其基因表達(dá)變化具有很大差別。S.thermophilus TF96細(xì)胞中oatA基因在轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控細(xì)胞膜對(duì)外界脅迫環(huán)境的應(yīng)答，oatA基因轉(zhuǎn)錄水平隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下調(diào)，當(dāng)菌體處于T3時(shí)，與T1相比其表達(dá)量顯著下調(diào)了1.3倍，研究表明oatA能夠抵御肽聚糖水解酶對(duì)細(xì)胞壁的水解。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，oatA基因表達(dá)量逐漸降低，菌體自溶增加。⑷在S.thermoph

11、ilus TF96增殖培養(yǎng)的發(fā)酵液中檢測(cè)到乳酸、乙酸、乙醇和乙醛等小分子代謝化合物豐度發(fā)生變化。從T1開始乙醛、乙醇和乙酸胞外豐度顯著增加，從T3到T4，培養(yǎng)基中乙醛和乙酸豐度有所下調(diào)。細(xì)胞內(nèi)乙醛和乙醇豐度在T1和T2時(shí)沒有明顯變化，但是乙醛的豐度在T3時(shí)顯著增加，隨后在T4時(shí)明顯下降至31.98±3.73，然而從T3到T4，乙醇的豐度顯著提高到13.25±5.83，乙酸在開始發(fā)酵階段隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)豐度逐漸增加，從4915.26±7