基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的顱腦創(chuàng)傷之“瘀血內(nèi)?！辈±頇C(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：顱腦創(chuàng)傷（TBI）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，死、殘率位居各類創(chuàng)傷之首，是亟待解決的世界性公共健康和社會(huì)問題。《靈樞》云“若有所墜墮，惡血留內(nèi)而不去”，指出TBI的中醫(yī)病機(jī)為“瘀血內(nèi)停”。瘀血是指體內(nèi)血液停聚形成的病理產(chǎn)物，“瘀血內(nèi)?！奔答鲅e聚體內(nèi)，阻滯氣機(jī)，影響血脈運(yùn)行，導(dǎo)致局部或全身血液運(yùn)行失常。凝血系統(tǒng)和纖溶、抗凝系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)血液的順暢流動(dòng)具有重要意義，當(dāng)凝血功能出現(xiàn)異常，血液可能凝固于血管之中。歷代中醫(yī)家根據(jù)“

2、瘀血內(nèi)?！钡牟C(jī)，以活血化瘀為TBI的基本治法，取得了一定的臨床療效。然而迄今為止，對(duì)“瘀血內(nèi)?！辈C(jī)的研究仍處于理論探討階段，缺乏深入的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究旨在通過對(duì)臨床患者凝血功能的檢驗(yàn)證明“瘀血內(nèi)?！笔秋B腦創(chuàng)傷的基本病機(jī)，并運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探索凝血功能相關(guān)的基因和通路。
　　方法：收集2014年6月至2015年5月間在中國武警腦科醫(yī)院神經(jīng)重癥科住院的TBI患者，并分別于創(chuàng)傷后6 h、12 h、24 h收集患者靜脈血和腦脊液

3、標(biāo)本。將采集的靜脈血用于檢驗(yàn)?zāi)δ埽≒T、APTT、Fg、DD、PLT），并運(yùn)用Western Blot方法檢測(cè)腦脊液中蛋白表達(dá)變化，比較各時(shí)間點(diǎn)凝血指標(biāo)的變化差異及腦脊液蛋白變化趨勢(shì)。
　　運(yùn)用CICⅡ型細(xì)胞損傷儀建立SH-SY5Y細(xì)胞牽張損傷模型，根據(jù)不同損傷力度、不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞存活率，確定損傷所用模型。將牽張損傷的細(xì)胞作為損傷組，不損傷的細(xì)胞作為對(duì)照組。提取對(duì)照組和損傷組細(xì)胞總RNA，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodro

4、p和Agilent2100檢測(cè)評(píng)估RNA質(zhì)量。對(duì)符合建庫要求的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序（RNA-seq），通過堿基錯(cuò)誤率、GC含量檢驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，將測(cè)序得到的序列與參考基因進(jìn)行比對(duì)，得到各基因名稱、計(jì)算基因表達(dá)量。運(yùn)用皮爾遜相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的重復(fù)性，將readcount>100且兩組數(shù)據(jù)相比readcount變化超過50％的基因認(rèn)定為差異表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類、KEGG富集和IPA分析，并且隨機(jī)選取10余個(gè)基

5、因運(yùn)用qPCR進(jìn)行變化趨勢(shì)驗(yàn)證。
　　結(jié)果：本研究共收集到32例TBI患者，男性24例，女性8例。腦脊液蛋白Western Blot結(jié)果顯示，Plg和AT-Ⅲ的含量變化與創(chuàng)傷時(shí)間相關(guān)，創(chuàng)傷6 h時(shí)腦脊液中Plg含量較高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸減低，而AT-Ⅲ在6 h時(shí)腦脊液中含量較少，隨著創(chuàng)傷時(shí)間的延長(zhǎng)含量增加。TBI患者凝血功能檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常水平之內(nèi)PT和APTT隨時(shí)間變化而升高，PLT隨時(shí)間變化而減低。DD和Fg在創(chuàng)傷6

6、 h時(shí)明顯高出正常水平，其中DD隨著時(shí)間下降但仍高于正常水平，而Fg的變化則是先升高，再下降，在創(chuàng)傷24 h又出現(xiàn)小幅回升。
　　運(yùn)用中度損傷培養(yǎng)12 h建立SY5Y細(xì)胞牽張損傷模型，提取的RNA質(zhì)量較好，滿足 RNA-seq建庫要求。兩組樣本測(cè)序得到的基因比對(duì)到參考序列外顯子的比率均超過90%。兩組數(shù)據(jù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)均大于0.95，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。
　　通過篩選得到差異表達(dá)基因1422條，與對(duì)照組相比，1197條基因

7、表達(dá)上調(diào)，225條基因表達(dá)下調(diào)。通過差異基因的GO分析與KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)損傷組與對(duì)照組在多種代謝途徑上存在差異，且富集得到多條能量代謝通路以及凋亡通路。qPCR檢測(cè)基因變化趨勢(shì)得到與RNA-seq相似的結(jié)果。IPA分析獲得1條以HIF-1α為中心的調(diào)節(jié)通路，在該通路中，HIF-1α表達(dá)下調(diào)，保護(hù)神經(jīng)元，減少瘀血生成，阻止細(xì)胞死亡，并通過磷酸化H2AFX起到修復(fù)受損DNA的作用，從降低細(xì)胞死亡率。
　　結(jié)論：本研究表明TBI早