“磁場-PST磁性納米微粒”體系對雪旺細(xì)胞定向遷移的作用研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）往往造成嚴(yán)重的后果，患者往往伴隨終身的功能障礙，為社會及家庭地帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，促進(jìn)脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)，提高功能恢復(fù)水平，顯得迫切且必要。細(xì)胞移植對于脊髓損傷后的功能恢復(fù)具有顯著的作用。雪旺細(xì)胞（Schwann cell，SC）是外周神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nerve injury，PNI）的成髓鞘細(xì)胞，對于神經(jīng)的再生與修復(fù)具有明確且顯著的作用；雪旺細(xì)胞能夠分泌多種促

2、進(jìn)并維持神經(jīng)軸突生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子以及對再生軸突具有引導(dǎo)作用的支持基質(zhì)，同時，雪旺細(xì)胞還能夠再髓鞘包裹、保護(hù)再生的神經(jīng)軸突以及脫髓鞘的神經(jīng)軸突，為再生的神經(jīng)軸突“搭橋鋪路”，引導(dǎo)其延伸進(jìn)入脊髓損傷遠(yuǎn)端，進(jìn)而促進(jìn)功能的恢復(fù)；因此，雪旺細(xì)胞是最具有臨床應(yīng)用前景的治療脊髓損傷的種子細(xì)胞之一。
　　雪旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷仍然還有很多局限性限制了療效的進(jìn)一步提高。雪旺細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，C

3、NS）后，細(xì)胞的遷移能力受到極大限制，宿主星形膠質(zhì)細(xì)胞包裹雪旺細(xì)胞，二者形成明顯的細(xì)胞邊界，無法實現(xiàn)引導(dǎo)再生神經(jīng)軸突的修復(fù)作用，與星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的邊界也阻礙了再生軸突的長入。
　　采用基因修飾的辦法將多聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶（Polysialyltransferase，PST）轉(zhuǎn)染進(jìn)入雪旺細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞過表達(dá)唾液酸化的神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(Polysialylation of neural cell adhesion molecule，PS

4、A-NCAM)，提高細(xì)胞的遷移能力，動物實驗證實脊髓損傷部位再生軸突增多，功能恢復(fù)水平提高。因此，我們設(shè)想，利用SPIONs將PST磁轉(zhuǎn)染進(jìn)入雪旺細(xì)胞，一方面，PST表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)雪旺細(xì)胞的遷移能力，另一方面，通過施加外部磁場對細(xì)胞施加定向牽引力，引導(dǎo)雪旺細(xì)胞的定向遷移。通過上述策略，增強(qiáng)雪旺細(xì)胞的定向遷移能力，以提高雪旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷的療效。
　　第一部分、磁性納米微粒的物理特性及其對雪旺細(xì)胞生物活性的影響
　　目的

5、：明確磁性納米微粒的物理形態(tài)及表面電勢，入胞后在細(xì)胞內(nèi)的分布形態(tài)；明確PEI-SPIONs磁轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞的細(xì)胞毒性，篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度。
　　方法：利用透射電子顯微鏡測量 PEI-SPIONs的粒徑并觀察其分布形態(tài)，利用Zeta電勢/粒徑測量儀分布測量PEI-SPIONs及PEI-SPIONs/PST復(fù)合物的粒徑及表面電勢；利用CCK-8試劑盒及細(xì)胞活-死染色試劑盒明確不同濃度PEI-SPIONs磁轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后的細(xì)胞活性及死亡細(xì)胞

6、比率。
　　結(jié)果：透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)：PEI-SPIONs的平均粒徑為28.2?3.6nm，PEI-SPIONs的磁飽和度在3.382Oe時為61.62emu/g，Zeta電勢/粒徑測量儀測得PEI-SPIONs粒徑為186.5?23.4nm，表面電勢為19.20?3.2mV；測得PEI-SPIONs/PST復(fù)合物的平均粒徑為378.8?109.1nm，表面電勢為17.51?2.4mV。磁轉(zhuǎn)染24h后，PEI-SPIONs磁轉(zhuǎn)染濃

7、度低于4μg/μL時，死細(xì)胞的比例為3.01％-5.26%，當(dāng)磁轉(zhuǎn)染后72h時，死亡細(xì)胞比例與磁轉(zhuǎn)染后24h相比無統(tǒng)計學(xué)差異；磁轉(zhuǎn)染濃度為8μg/μL時，轉(zhuǎn)染24h及72h后死亡細(xì)胞比例分別增加至6.41%±1.03%和6.63%±1.16%；CCK-8試劑盒分析細(xì)胞活性，磁轉(zhuǎn)染后24h及72h，轉(zhuǎn)染濃度0μg/μL，1μg/μL，2μg/μL，4μg/μL之間，細(xì)胞活性無統(tǒng)計學(xué)差異，當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度提高至8μg/μL時，磁轉(zhuǎn)染后24h及72

8、h細(xì)胞活性分別下降19.23%和22.41%。
　　結(jié)論：PEI-SPIONs及PEI-SPIONs/PST復(fù)合物的陽性表面電勢更適于細(xì)胞吞入；在磁轉(zhuǎn)染PEI-SPIONs濃度?8μg/μL時，對細(xì)胞的毒性較小；透射電子顯微鏡及Zeta電勢/粒徑測量儀所測得的粒徑差異可能歸因于Zeta電勢/粒徑測量儀標(biāo)本時，表面帶電荷的PEI-SPIONs發(fā)生的聚集現(xiàn)象。
　　第二部分：PST磁性納米微粒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞對PSA-NCAM表達(dá)的

9、影響
　　目的：確定PEI-SPIONs/PST磁轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)PSA-NCAM表達(dá)的影響。
　　方法：利用掃描電子顯微鏡觀察磁轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞形態(tài)以及PEI-SPIONs貼附至細(xì)胞膜的形態(tài)及分布，利用透射電子顯微鏡觀察磁轉(zhuǎn)染后PEI-SPIONs在雪旺細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的分布形態(tài)；利用 PCR測定不同PEI-SPIONs轉(zhuǎn)染濃度及不同質(zhì)量比PEI-SPIONs/PST磁轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對PST mRNA水平的影響，Western b

10、lot檢測磁轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞內(nèi)PSA-NCAM的蛋白表達(dá)水平，利用免疫熒光染色特異性標(biāo)記PSA-NCAM，觀察PEI-SPIONs/PST磁轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后PSA-NCAM的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：磁轉(zhuǎn)染6h后，掃描電子顯微鏡可以觀察到細(xì)胞膜上有顆粒狀物，而在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞膜上沒有觀察到；磁轉(zhuǎn)染后24h，在雪旺細(xì)胞之內(nèi)能夠觀察到一簇顆粒狀物，表明了PEI-SPIONs已經(jīng)貼附到細(xì)胞膜上通過內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；PCR結(jié)果表明，隨著PE

11、I-SPIONs轉(zhuǎn)染濃度從1μg/mL上升至4μg/mL，PST的mRNA水平也明顯的增高；另外，隨著PEI-SPIONs/PST的質(zhì)量比從1:2提高至1:4，PST的mRNA水平在PEI-SPIONs濃度1μg/mL時上升了2.20倍，2μg/mL時上升了20.11倍，4μg/mL時上升了1.89倍。在PEI-SPIONs轉(zhuǎn)染濃度4μg/mL，PEI-SPIONs/PST質(zhì)量比1:4時，PST的mRNA水平是正常對照組的1041倍；W

12、estern blot結(jié)果顯示，PEI-SPIONs/PST磁轉(zhuǎn)染組的 PSA-NCAM蛋白表達(dá)水平明顯增高，但在對照組中僅僅檢測到了很少的表達(dá)；PEI-SPIONs/PST磁轉(zhuǎn)染組雪旺細(xì)胞特異性 PSA-NCAM染色顯示表達(dá)水平很高，而在對照組幾乎沒有PSA-NCAM特異性染色標(biāo)記。
　　結(jié)論：通過PCR檢測PST的mRNA水平以及Western blot和免疫熒光染色測定細(xì)胞 PSA-NCAM的表達(dá)水平，我們可以看出 PST磁

13、轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，并且誘導(dǎo)了細(xì)胞PSA-NCAM的高表達(dá)。首次成功使用磁轉(zhuǎn)染技術(shù)成功轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞并誘導(dǎo)了PSA-NCAM的高表達(dá)。
　　第三部分：外部磁場對PST磁轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞遷移及定向能力的影響
　　目的：探索外部磁場對磁轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞在星形膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)境中的遷移及定向能力的影響。
　　方法：利用雪旺細(xì)胞在星形膠質(zhì)細(xì)胞層上的遷移實驗測試雪旺細(xì)胞的遷移能力，測量遷出雪旺細(xì)胞的最大遷移距離，平均遷移距離，遷出

14、細(xì)胞數(shù)量以及遷出雪旺細(xì)胞的定向指數(shù)；利用雪旺細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞分區(qū)共培養(yǎng)實驗，測試雪旺細(xì)胞能否穿越星形膠質(zhì)細(xì)胞邊界，進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域，測量遷入星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域的雪旺細(xì)胞數(shù)目以及遷入的平均距離。
　　結(jié)果：當(dāng)PST磁轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞時，在外部磁場作用下，細(xì)胞在星形膠質(zhì)細(xì)胞層上的遷移能力被更進(jìn)一步增強(qiáng)，并且細(xì)胞的遷移方向規(guī)律地沿著外部磁場的方向排列；PST磁轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞在有外部磁場時（56.8?9.72/500?m，p?0.05），在

15、特定距離玻片邊緣的遷出數(shù)量明顯多于無磁場時（46.3?6.47/500?m，p?0.05）。在有外部磁場時，PEI-SPIONs/PST/SC以及PEI-SPIONs/DNA/SC實驗組的雪旺細(xì)胞均能打破與星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞邊界并且沿著外部磁場方向規(guī)律排列；但PEI-SPIONs/PST/SC遷移進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量是PEI-SPIONs/DNA/SC的1.85倍（p?0.05）。
　　結(jié)論：PST磁轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞使細(xì)胞