基于磁球信號放大技術的超靈敏DNA檢測方法及其在測定基因表達中的應用.pdf

1、DNA是生命現(xiàn)象中不可缺少的生物大分子，是生命體內的基因物質，也是遺傳信息的攜帶者。檢測與疾病有關的變異基因對基因篩選、遺傳疾病的早期診斷和治療具有十分深遠的意義。因此，隨著分子生物學研究的深入DNA的檢測手段變得越來越重要。本論文以DNA這一生物大分子為研究對象，將磁球放大技術、核酸雜交技術與光電化學分析技術相結合，研制新型的高靈敏、高選擇性的DNA檢測方法，并成功應用于檢測細胞中的基因表達。主要內容如下:
　　 第一章，主要

2、對DNA的檢測方法及檢測中放大技術進行了簡要的綜述。DNA檢測方法可分為標記型與無標記型，標記型方法主要有熒光分析法、電化學方法、化學發(fā)光法、電化學發(fā)光法等，無標記的方法涉及到表面等離子共振技術和石英微晶天平法等。本章還介紹了檢測DNA中的放大技術，包括核酸體外擴增和檢測物信號放大技術兩方面，其中基于酶反應、納米粒子和微磁球的信號放大技術進行了著重介紹。
　　 第二章，我們研究了兩種以亞微米磁球(MB)為載體標記Ru(bpy)3

3、2+-NHS的超靈敏檢測人乳腺癌細胞中beta-2-microglobulin(β2M)mRNA的電化學發(fā)光(ECL)法。第一種方法是用ECL光譜法。這種方法的方案是:修飾有生物素化的捕捉DNA(B-DNAc)的基底通過雜交反應依次連接上目標DAN(t-DNA)、生物素化的探針DNA(B-DNAp)和鏈霉親和素化的磁球(SA-MBs)。然后通過去雜交反應將SA-MBs從基底上釋放下來，并標記上Ru(bpy)32+-NHS。標記了Ru(b

4、py)32+-NHS的MBs固定在金電極上后，利用多通道光學分析儀采集Ru(bpy)32+-NHS的電化學發(fā)光光譜圖。通過該方法我們測得人乳腺癌細胞中β2MmRNA的檢測限達到1.2×10-15mol/L。第二種方法是以碳納米管(CNTs)作為輔助電極材料包裹標記了Ru(bpy)32+-NHS的MBs，再用ECL方法檢測細胞中基因的表達水平，β2MmRNA的檢測限可達3×10-16mol/L。
　　 第三章，我們研究了一種新的熒

5、光檢測痕量DNA的信號放大方法—磁球表面DNA雜交-去雜交信號放大方法。該方法首先將修飾了B-DNAp的SA-MBs(DNAp-MBs)以1∶1的比例連接到基底上的t-DNA上。通過DNA之間去雜交方式將DNAp-MBs釋放下來，然后與標記了Cy5的檢測DNA(Cy5-DNAd)進行雜交。通過DNAp-MBs和Cy5-DNAd之間去雜交反應，收集釋放得到的Cy5-DNAd。而分離得到的DNAp-MBs可以再次與其他的Cy5-DNAd進行

6、雜交-去雜交反應。經多次雜交-去雜交循環(huán)過程后可以收集大量Cy5-DNAd。最終，將所有收集到的Cy5-DNAd進行熒光檢測。經11次循環(huán)放大后t-DNA的檢測限為8.5×10-15mol/L。我們將該超靈敏方法用于檢測人乳腺癌細胞中RPLP2mRNA的檢測。
　　 第四章，研究了一種新穎的基于多色編碼微珠單分子檢測多種DNA的技術，通過同時檢測三種DNA及細胞中的多基因表達證明了該技術的可行性。該方法通過精確控制納米磁球上標記