基于體積放大技術(shù)的單個DNA分子檢測.pdf

1、第一章對單分子檢測及磁球技術(shù)進行了綜述。首先介紹了單分子檢測的研究概況，主要包括單分子檢測的主要內(nèi)容、特點和采用的技術(shù)，重點介紹了單分子檢測所采用的技術(shù)，涉及到光學(xué)方法、掃描探針顯微方法和化學(xué)方法。其次介紹了磁球的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用，重點介紹了磁球在DNA的分離與檢測、酶的固定化、細胞分選、免疫檢測等的應(yīng)用。 第二章中用一種新的、簡單的方法檢測單個pUC19質(zhì)粒DNA分子。首先取一定量的磁球(直徑0.35μm)與過量捕捉探針反應(yīng)，利

2、用磁分離除去過量的捕捉探針，然后將少量目標DNA分子與遠遠過量的上述連接有捕捉探針的磁球在雜交緩沖溶液中充分反應(yīng)，這樣一個目標DNA分子通過雜交反應(yīng)會結(jié)合到一個磁球上。第二步取一定量的微球(直徑9.95μm)與檢測探針反應(yīng)，通過離心分離、清洗除去過量的檢測探針。第三步將上述兩步反應(yīng)的產(chǎn)物按一定比例混合，進行雜交反應(yīng)，最終通過目標DNA分子與磁球-微球的聯(lián)結(jié)，形成磁球-目標DNA-微球的夾心復(fù)合體。因為在以上比例下結(jié)合了檢測探針微球的濃度

3、大大地大于結(jié)合了目標DNA磁球的濃度，所以只有一個結(jié)合了單個目標DNA分子的磁球可以結(jié)合到微球上。用磁分離除去未反應(yīng)的微球，將此溶液清洗后滴加在載玻片上，用倒置顯微鏡以十或二十倍物鏡用或者一百或二百倍物鏡觀察。在顯微鏡下看到的微球，就是一個磁球-目標DNA-微球的夾心復(fù)合體。其觀測到的微球數(shù)目也就是單個目標DNA分子的數(shù)目。這個方法的最大優(yōu)點是不需用復(fù)雜而昂貴的儀器，只用普通的顯微鏡配合常用的CCD(也可用目視)就可實現(xiàn)單個DNA分子的

4、檢測。 第三章同樣采用了磁/微球技術(shù)的體積放大效應(yīng)，通過增加反應(yīng)時間和用自制振蕩器改變震蕩條件提高了雜交反應(yīng)產(chǎn)率，以炭疽熱的單個DNA分子為目標，研究了單分子個數(shù)與濃度的定量關(guān)系。為了準確、方便地進行單分子計數(shù)，制作了底部刻蝕有坐標方格的小池子，然后在倒置顯微鏡下按照坐標方格移動載物臺，用CCD對每個小池子進行拍照。因為有坐標方格作為參照標準，所以拍出的照片就不會出現(xiàn)重復(fù)和遺漏。然后再根據(jù)拍出的照片，對微球個數(shù)進行單分子計數(shù)。對