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文檔簡介
1、鏈霉菌具有豐富的代謝調(diào)控機制,由于鏈霉菌在抗生素合成中的重要地位,研究鏈霉菌的次級代謝特別是抗生素合成的調(diào)控機制具有重要的研究意義。本文主要研究天藍鏈霉菌中的雙組份調(diào)控系統(tǒng)AfsQ1/Q2對抗生素coelimycin P2(也被稱為yCPK)合成的調(diào)控機制。
之前的研究表明,在以75mM的谷氨酸鈉(Glu)為唯一氮源的基本培養(yǎng)基(MM)上,天藍色鏈霉菌中的雙組份調(diào)控系統(tǒng)(TCS)AfsQ1/Q2可以激活黃色的抗生素coelim
2、ycin P2(也被稱為yCPK)的產(chǎn)生,并且應(yīng)答調(diào)控蛋白AfsQ1能夠結(jié)合到coelimycin P2的兩個生物合成基因cpkA和cpkD的基因間隙。本文對此進行了更加深入的研究。為了排除放線紫紅素(ACT)、十一靈菌紅素(RED)(分別呈現(xiàn)藍色和紅色)對我們?nèi)庋塾^察coelimycin P2產(chǎn)量變化的干擾,本研究以野生型天藍鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)M145為出發(fā)菌株,敲除了ACT和RED生物合成基因簇
3、中的途徑特異性調(diào)控基因actII-ORF4、redD,獲得菌株SBJ512,該菌株喪失ACT和RED的合成能力。我們首先探究了在基本培養(yǎng)基(MM)上,不同濃度的谷氨酸鈉對coelimycin P2合成的影響,發(fā)現(xiàn)在谷氨酸鈉濃度為75mM的條件下, SBJ512的coelimycin P2的合成量最多。在含有75mM的谷氨酸鈉為唯一氮源的MM培養(yǎng)基上,探究了雙組份系統(tǒng)基因afsQ1/Q2缺失對coelimycin P2合成的影響。結(jié)果表明
4、,當缺失afsQ1/Q2之后,突變菌株SBJ513停止合成coelimycin P2,并且我們對coelimycin P2合成基因簇進行了轉(zhuǎn)錄分析,發(fā)現(xiàn)afsQ1/Q2缺失導致整個coelimycin P2生物合成基因簇轉(zhuǎn)錄的顯著下調(diào),其中cpkA/B/C轉(zhuǎn)錄下調(diào)的最厲害,下調(diào)了約20倍,凝膠阻滯實驗(EMSA)表明, AfsQ1僅僅能夠結(jié)合到coelimycin P2合成基因簇中聚酮合酶基因cpkA/cpkD之間的間隙區(qū),而不能結(jié)合到
5、基因簇內(nèi)其他可能的啟動子區(qū)域。根據(jù)之前蛋白AfsQ1結(jié)合基序的保守性,在cpkA/cpkD之間找到了AfsQ1的結(jié)合序列,并對其進行原位堿基突變,構(gòu)建了突變體SBJ514。對該菌株進行轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn),cpkA/D基因間隔區(qū)內(nèi)AfsQ1結(jié)合位點的突變僅引起 cpkA/B/C(編碼三個大的Ⅰ類聚酮合酶)的轉(zhuǎn)錄下調(diào),而其他基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的變化或有明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明,AfsQ1/Q2可能通過結(jié)合于cpkA和cpkD的基因間隙區(qū),影響3
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