天藍(lán)色鏈霉菌代謝物組測(cè)定方法的建立和土霉素外排機(jī)制的研究.pdf

1、鏈霉菌擁有豐富的初級(jí)代謝途徑和強(qiáng)大的次級(jí)代謝能力，它的次級(jí)代謝產(chǎn)物是小分子藥物的重要來(lái)源，鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成受到很多復(fù)雜的調(diào)控，研究其調(diào)控的分子機(jī)制，可以為理性提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供理論依據(jù)，也可為指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的代謝產(chǎn)物。
　　本研究論文主要包括兩部分內(nèi)容，一部分是建立了一種快速、準(zhǔn)確的鏈霉菌胞內(nèi)代謝物的分析方法:以模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌為研究對(duì)象，基于GC-MS分析平臺(tái)優(yōu)化了代謝組學(xué)樣品制備流程中的細(xì)胞淬滅時(shí)

2、間、菌體分離方法、代謝物提取及代謝物衍生化條件，并利用該方法對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌不同生長(zhǎng)時(shí)期各代謝物的相對(duì)活性進(jìn)行了初步分析。采用“低溫淬滅(-40℃，4 min)-快速過(guò)濾分離-反復(fù)凍融(45 s/3 min)-衍生化(40℃，90 min)”的流程能夠鑒定出中心代謝途徑（糖酵解、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)）、氨基酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑、核酸代謝途徑及部分次級(jí)代謝途徑中的103種主要代謝物。利用該流程測(cè)定發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞生長(zhǎng)周期中存在

3、顯著的代謝時(shí)序差異，并且發(fā)現(xiàn)氨基酸與脂肪酸代謝在銜接初級(jí)代謝與次級(jí)代謝生物合成中具有重要作用。本研究建立的測(cè)定方法能夠有效地用于天藍(lán)色鏈霉胞內(nèi)代謝物分析，該方法將有助于深入刻畫(huà)鏈霉菌細(xì)胞代謝過(guò)程，為菌株代謝工程改造增加次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供理性指導(dǎo)。
　　第二部分工作是土霉素合成調(diào)控蛋白OtrR及其與土霉素相互作用關(guān)系的研究。很多微生物能夠產(chǎn)生具有抗生素活性的分子，使之在與外界其他微生物共存時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，但是這些抗生素小分子積累至

4、一定濃度時(shí)往往對(duì)自身也產(chǎn)生毒害作用，因此要利用外排系統(tǒng)將合成的這些次級(jí)代謝產(chǎn)物運(yùn)出體外。其中比較有代表性的是TetR-tetA外排系統(tǒng)，TetR調(diào)控蛋白通過(guò)N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合靶DNA，抑制外排基因tetA的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)自身產(chǎn)生的抗生素類小分子達(dá)到一定濃度時(shí)，可以與TetR蛋白C端配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，使其從靶DNA上解離下來(lái)，從而能夠解除對(duì)靶基因外排泵基因的轉(zhuǎn)錄抑制，使抗生素小分子泵出體外，這樣的系統(tǒng)我們稱之

5、為“TetR調(diào)控蛋白-抗性基因”系統(tǒng)。本工作的研究對(duì)象是龜裂鏈霉菌的土霉素合成基因簇中的調(diào)控基因OtrR與外排泵基因otrB。這兩個(gè)基因反向轉(zhuǎn)錄，與產(chǎn)金霉素的金色鏈霉菌的CtcS-ctcR和大腸桿菌的TetR-tetA排布相同。途徑特異性調(diào)控蛋白與外排泵基因在基因組上毗鄰，而且反向轉(zhuǎn)錄，我們推測(cè)其外排泵基因可能也受其調(diào)控蛋白的直接抑制。OtrR是MarR家族的蛋白，通常以二聚體形式存在直接與DNA結(jié)合，很多MarR蛋白是抑制蛋白，小分子

6、通過(guò)有活性的半胱氨酸殘基可與MarR結(jié)合將蛋白從DNA上解離下來(lái)。首先我們對(duì)OtrR進(jìn)行了異源表達(dá)和純化，得到了純度較高的帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，然后通過(guò)體外EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)OtrR不僅與自身啟動(dòng)子PotrR-otrB結(jié)合，也能與金色鏈霉菌抗性調(diào)節(jié)蛋白CtcR啟動(dòng)子PctcR-ctcS結(jié)合。因此，我們推測(cè)PotrR-otrB和PctcR-ctcS中可能存在相對(duì)保守的結(jié)合序列。通過(guò)序列同源性比對(duì)得到PotrR-otrB和PctcR-ct

7、cS共同存在的14bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，初步推測(cè)P14bp可能是OtrR結(jié)合的靶序列。體外EMSA實(shí)驗(yàn)與SPR實(shí)驗(yàn)均證明這段序列可與OtrR結(jié)合，且SPR實(shí)驗(yàn)得到OtrR與結(jié)合的靶序列的親和力為0.14 nM。SPR實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明OtrR能夠與自身產(chǎn)生的抗生素土霉素素結(jié)合。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，除土霉素外，四環(huán)素類抗生素，四環(huán)素，強(qiáng)力霉素，金霉素都能解除OtrR對(duì)自身的抑制。這也印證了我們之前的猜想，OtrR-otrB行使著“TetR-tetA調(diào)