天藍(lán)色鏈霉菌代謝物組測定方法的建立和土霉素外排機(jī)制的研究.pdf

1、鏈霉菌擁有豐富的初級代謝途徑和強(qiáng)大的次級代謝能力，它的次級代謝產(chǎn)物是小分子藥物的重要來源，鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物的生物合成受到很多復(fù)雜的調(diào)控，研究其調(diào)控的分子機(jī)制，可以為理性提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供理論依據(jù)，也可為指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的代謝產(chǎn)物。
　　本研究論文主要包括兩部分內(nèi)容，一部分是建立了一種快速、準(zhǔn)確的鏈霉菌胞內(nèi)代謝物的分析方法:以模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌為研究對象，基于GC-MS分析平臺優(yōu)化了代謝組學(xué)樣品制備流程中的細(xì)胞淬滅時(shí)

2、間、菌體分離方法、代謝物提取及代謝物衍生化條件，并利用該方法對天藍(lán)色鏈霉菌不同生長時(shí)期各代謝物的相對活性進(jìn)行了初步分析。采用“低溫淬滅(-40℃，4 min)-快速過濾分離-反復(fù)凍融(45 s/3 min)-衍生化(40℃，90 min)”的流程能夠鑒定出中心代謝途徑（糖酵解、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)）、氨基酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑、核酸代謝途徑及部分次級代謝途徑中的103種主要代謝物。利用該流程測定發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞生長周期中存在

3、顯著的代謝時(shí)序差異，并且發(fā)現(xiàn)氨基酸與脂肪酸代謝在銜接初級代謝與次級代謝生物合成中具有重要作用。本研究建立的測定方法能夠有效地用于天藍(lán)色鏈霉胞內(nèi)代謝物分析，該方法將有助于深入刻畫鏈霉菌細(xì)胞代謝過程，為菌株代謝工程改造增加次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供理性指導(dǎo)。
　　第二部分工作是土霉素合成調(diào)控蛋白OtrR及其與土霉素相互作用關(guān)系的研究。很多微生物能夠產(chǎn)生具有抗生素活性的分子，使之在與外界其他微生物共存時(shí)具有競爭優(yōu)勢，但是這些抗生素小分子積累至

4、一定濃度時(shí)往往對自身也產(chǎn)生毒害作用，因此要利用外排系統(tǒng)將合成的這些次級代謝產(chǎn)物運(yùn)出體外。其中比較有代表性的是TetR-tetA外排系統(tǒng)，TetR調(diào)控蛋白通過N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合靶DNA，抑制外排基因tetA的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)自身產(chǎn)生的抗生素類小分子達(dá)到一定濃度時(shí)，可以與TetR蛋白C端配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，使其從靶DNA上解離下來，從而能夠解除對靶基因外排泵基因的轉(zhuǎn)錄抑制，使抗生素小分子泵出體外，這樣的系統(tǒng)我們稱之

5、為“TetR調(diào)控蛋白-抗性基因”系統(tǒng)。本工作的研究對象是龜裂鏈霉菌的土霉素合成基因簇中的調(diào)控基因OtrR與外排泵基因otrB。這兩個(gè)基因反向轉(zhuǎn)錄，與產(chǎn)金霉素的金色鏈霉菌的CtcS-ctcR和大腸桿菌的TetR-tetA排布相同。途徑特異性調(diào)控蛋白與外排泵基因在基因組上毗鄰，而且反向轉(zhuǎn)錄，我們推測其外排泵基因可能也受其調(diào)控蛋白的直接抑制。OtrR是MarR家族的蛋白，通常以二聚體形式存在直接與DNA結(jié)合，很多MarR蛋白是抑制蛋白，小分子

6、通過有活性的半胱氨酸殘基可與MarR結(jié)合將蛋白從DNA上解離下來。首先我們對OtrR進(jìn)行了異源表達(dá)和純化，得到了純度較高的帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，然后通過體外EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)OtrR不僅與自身啟動(dòng)子PotrR-otrB結(jié)合，也能與金色鏈霉菌抗性調(diào)節(jié)蛋白CtcR啟動(dòng)子PctcR-ctcS結(jié)合。因此，我們推測PotrR-otrB和PctcR-ctcS中可能存在相對保守的結(jié)合序列。通過序列同源性比對得到PotrR-otrB和PctcR-ct

7、cS共同存在的14bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，初步推測P14bp可能是OtrR結(jié)合的靶序列。體外EMSA實(shí)驗(yàn)與SPR實(shí)驗(yàn)均證明這段序列可與OtrR結(jié)合，且SPR實(shí)驗(yàn)得到OtrR與結(jié)合的靶序列的親和力為0.14 nM。SPR實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明OtrR能夠與自身產(chǎn)生的抗生素土霉素素結(jié)合。我們通過實(shí)驗(yàn)證明，除土霉素外，四環(huán)素類抗生素，四環(huán)素，強(qiáng)力霉素，金霉素都能解除OtrR對自身的抑制。這也印證了我們之前的猜想，OtrR-otrB行使著“TetR-tetA調(diào)