Shewanella oneidensis鞭毛絲亞基蛋白的翻譯后修飾及FlaA和FlaB功能差異研究.pdf

1、在翻譯結束之后，許多蛋白必須經過適當的修飾才具有其生物學功能，糖基修飾是其中最普遍的一種方式，尤其對鞭毛絲亞基蛋白而言。在許多致病菌株中，鞭毛絲亞基蛋白的糖基化修飾已經得到了很好的研究。但是關于Shewanella oneidensis這類蛋白的糖基修飾還未見報道。S.oneidensis的運動依賴于由兩種鞭毛絲亞基蛋白亞基FlaA和FlaB組裝而成的單極性鞭毛。盡管FlaA和FlaB的氨基酸序列非常保守，但二者在功能上存在顯著差別:F

2、laB為主要功能的鞭毛絲亞基蛋白而FlaA功能極其有限。在本論文中，我們利用nanoLC-MS/MS及一系列的生物技術，系統(tǒng)研究了FlaB鞭毛絲亞基蛋白的翻譯后修飾，確定了與功能直接相關的氨基酸殘基，并分析了造成FlaA和FlaB功能差異的主要原因，取得了以下結果:
　　 1.構建了適合在不影響功能前提下過量表達鞭毛絲亞基蛋白的遺傳體系;利用該系統(tǒng)表達、提取和純化了具主要功能的FlaB;利用nanoLC-MS和nanoLC-MS

3、/MS分析了用胰蛋白酶消化形成的多肽。2.結合半胱氨酸突變掃描技術，分析發(fā)現(xiàn)了S.oneidensisFlaB鞭毛絲亞基蛋白的五個絲氨酸殘基被O-linked糖基修飾，并且在同一位點修飾糖基的分子量經常存在14Da的差異。這說明翻譯后修飾的糖由兩部分組成:一部分是分子量恒定的糖基(274Da)，另一部分是分子量以14Da為差異單位可變的糖基，該14Da為差異單位推測為甲基。3.FlaB中大量的賴氨酸被甲基修飾。通過研究確定了S.onei

4、densis的甲基轉移酶為FliB(SO4160)，是與Salmonella enterica serovar Typhimurium甲基轉移酶同源的蛋白。
　　 4.為了解開S.oneidensis序列高度相似的兩個鞭毛絲亞基蛋白FlaA和FlaB的巨大功能差異之謎，系統(tǒng)分析了這兩個蛋白的編碼基因啟動子、T3SS蛋白分泌指導序列、鞭毛絲亞基蛋白三維結構及兩個蛋白可變區(qū)內的不同氨基酸等對其功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)FlaA和FlaB盡

5、管在啟動子活性和蛋白分泌方面存在一定不同，但這些不足以解釋其功能上的巨大差異。與之相反，在蛋白序列和結構上的些微區(qū)別卻決定了FlaA和FlaB的顯著不同生物學作用。在第三個α-螺旋(α3)的C-端和Loop3鏈接區(qū)的氨基酸決定了FlaB為主要功能的鞭毛絲亞基蛋白，其中FlaB的T129位點和T134位點為關鍵的氨基酸。Shewanella的Loop4是可變區(qū)中保守性最高的區(qū)域，用丙氨酸突變掃描FlaB中Loop4的保守氨基酸，三個位點的