活性包涵體中酶催化反應(yīng)和底物專一性變化研究.pdf

1、1980年以前，人們普遍認(rèn)為包涵體中的蛋白質(zhì)是沒有活性的，需要在體外進(jìn)行復(fù)性后才能使蛋白質(zhì)具有活性。近年來，越來越多的研究表明，某些蛋白質(zhì)或酶，雖然表達(dá)在包涵體中，但依然保留其活性，這種包涵體被稱為活性包涵體(ActiveInclusion Bodies)。與可溶性表達(dá)的酶相比，在活性包涵體中表達(dá)的酶具有很多優(yōu)點，例如增加蛋白的表達(dá)量，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，易于提取和純化，并且可以重復(fù)使用等?；钚园w中的蛋白質(zhì)，是一種不可溶的聚集體，通

2、常伴隨著蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。然而，由于酶表達(dá)在活性包涵體中而導(dǎo)致酶的反應(yīng)和底物專一性發(fā)生變化這一觀點暫未被報道。為了解決這個問題，選擇了在生物技術(shù)和工業(yè)上有廣泛應(yīng)用的三種酶。尿卟啉原Ⅲ甲基轉(zhuǎn)移酶(UroporphyrinogenⅢ methyltransferase，UMT)，作為一種紅色熒光標(biāo)記，能夠催化多步甲基化反應(yīng)。真核生物的絲氨酸消旋酶(Serineracemase，SR)，能夠催化D-絲氨酸及其對映的異構(gòu)體L-絲氨酸的消旋反應(yīng)，

3、以及D-和L-絲氨酸的脫水反應(yīng)。人類D-氨基酸氧化酶(human D-amino acid oxidase,hDAAO)能夠催化多種D-氨基酸的高效氧化。已報道，表達(dá)在包涵體中的酵母DAAO是具有活性的，目前還沒有關(guān)于表達(dá)在包涵體中的UMT和SR的催化活性的報道。構(gòu)建了可以表達(dá)為可溶的和不可溶的兩種狀態(tài)的三種酶，在大腸桿菌中過表達(dá)這三種酶，并且對它們的活性進(jìn)行了分析。研究結(jié)果如下:
　　1.酶的構(gòu)建。無標(biāo)簽大麥UMT突變體UMT8

4、是可溶性表達(dá)的，由于融合標(biāo)簽對熒光蛋白的催化作用幾乎沒有影響，構(gòu)建了C-端融合了疏水標(biāo)簽ELK16的UMT8，從而降低了UMT8蛋白的可溶性表達(dá)。構(gòu)建無標(biāo)簽玉米SR則是為了防止N或C端融合標(biāo)簽對玉米SR的催化活性具有潛在影響。hDAAO融合SUMO標(biāo)簽，可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。所有的基因都是在T7啟動子的控制下表達(dá)的。
　　2.在大腸桿菌中過表達(dá)重組蛋白。構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。將可溶的和不可溶的目的蛋白進(jìn)

5、行分離和SDS-PAGE檢測。融合ELK16的UMT8在包涵體中表達(dá)。無標(biāo)簽的玉米SR和融合了SUMO的hDAAO在上清和沉淀中都有表達(dá)。
　　3.大麥UMT8蛋白可溶態(tài)和不可溶態(tài)的熒光分析。紫外光譜掃描結(jié)果顯示，表達(dá)大麥UMT8的可溶性蛋白有兩個吸收峰，分別是在354nm和375nm，它們是二甲基化和三基化反應(yīng)的熒光產(chǎn)物的特異性吸收峰，相反地，表達(dá)大麥UMT8-ELK16的可溶性蛋白的這兩個吸收峰明顯減小，說明UMT8形成不溶性

6、聚集體使其催化活性降低。熒光光譜掃描分析，結(jié)果顯示融合ELK16標(biāo)簽，降低了大麥UMT8三步甲基化反應(yīng)的熒光產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的聚集，大麥UMT8蛋白的可溶性降低會抑制其催化多步甲基化反應(yīng)。
　　4.可溶態(tài)和不可溶態(tài)的玉米SR催化消旋反應(yīng)和脫水反應(yīng)的活性測定?？扇苄员磉_(dá)的玉米SR同時具有消旋酶活性和脫水酶活性，而不可溶的玉米SR的脫水酶活性喪失。體外添加甘油和還原劑二硫蘇糖醇(DTT)，二者對兩種狀態(tài)的玉米SR的催化反應(yīng)專一性具有不同的

7、影響。結(jié)果說明玉米SR在活性包涵體中表達(dá)時，改變了其催化反應(yīng)的特異性。
　　5.表達(dá)在活性包涵體中的SUMO-hDAAO的產(chǎn)量與底物專一性分析。對融合蛋白的包涵體相對產(chǎn)量進(jìn)行測定，28℃誘導(dǎo)的SUMO-hDAAO包涵體占細(xì)胞濕重的比值為17.71％;而在37℃誘導(dǎo)的條件下，相對比值提高到了37.99％。不可溶的hDAAO也顯示出相應(yīng)的氧化三種D-氨基酸的底物特異性，但可溶的和不可溶的hDAAO蛋白質(zhì)之間的催化反應(yīng)活性的改變略有不同