基于微孔陣列芯片的通用多重PCR方法的建立及初步應(yīng)用研究.pdf

1、多重PCR能夠在單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中采用多對(duì)引物對(duì)多個(gè)目的核酸片段進(jìn)行同步檢測和分析，并且作為一種高效的技術(shù)手段，在基礎(chǔ)科研和臨床研究方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。但是，不同引物對(duì)之間的干擾和競爭使得傳統(tǒng)的多重PCR較難均衡、有效地?cái)U(kuò)增各目的片段，并且其成功擴(kuò)增的難度隨著待擴(kuò)增目標(biāo)片段數(shù)目的增加而加大。常規(guī)的多重PCR優(yōu)化方法可實(shí)現(xiàn)10重和10重以下的多重PCR的優(yōu)化，但均嚴(yán)重依賴操作者的經(jīng)驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以標(biāo)準(zhǔn)化，缺乏通用性。針對(duì)這一問題，我們

2、基于微孔陣列芯片并結(jié)合DNA微陣列作為檢測手段，建立了一套通用多重PCR及后續(xù)檢測策略。利用表面親疏水處理，我們可以在微孔陣列芯片上形成多個(gè)空間上相互隔離的微反應(yīng)體系，每個(gè)體系中含有一對(duì)特定的特異性引物和共同的模板，因此完全避免了引物對(duì)之間的相互干擾和競爭。通過實(shí)施11重PCR以及116重PCR，我們對(duì)該多重PCR方法的特性進(jìn)行了研究：靈活性實(shí)驗(yàn)顯示出它能夠?qū)﹄S機(jī)組合的模板進(jìn)行均衡的擴(kuò)增和檢測，而且無需特別優(yōu)化；靈敏度實(shí)驗(yàn)顯示該方法的檢

3、測極限在每個(gè)微孔5個(gè)拷貝以下，甚至可以達(dá)到單分子檢測；RNA以及 RNA和DNA的混合物通過多重反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)均能實(shí)現(xiàn)均衡而高效的擴(kuò)增；在116重單目的片段檢測實(shí)驗(yàn)中，99.1％（115/116）的目的片段呈現(xiàn)特異的陽性條帶或信號(hào)，在所有模板均存在的116重PCR實(shí)驗(yàn)中，陽性檢測率約為97.4%（112/115），這充分說明了它具有高通量檢測的能力。我們將該方法應(yīng)用于檢測由外顯子缺失引起的杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne