冰島硫化葉菌DExD-H-box家族解旋酶SiRe_0681與SiRe_1605的功能分析.pdf

1、DExD/H-box蛋白指的是一類具有NTP酶活性的，隸屬超級族2的DNA或RNA解旋酶，廣泛存在于全部的真核生物細胞和大多數(shù)的細菌與古菌中，并且在這些物種中都具有很高的保守性。DExD/H-box解旋酶普遍具有9個保守的基序，基序Ⅱ中存在核心的保守氨基酸序列D-E-A-D(asp-glu-ala-asp)，這個基序被認為是ATP的結合位點，ATP水解為解旋酶的解旋活性提供能量，也根據(jù)這個基序對整個蛋白家族進行命名。DExD/H-box

2、解旋酶參與許多細胞進程，在核酸代謝過程中起著重要作用，比如參與雙鏈解旋、mRNA前體加工、轉錄、翻譯、以及mRNA降解、基因損傷修復、核糖體生物合成、核糖核蛋白(RNP)復合體重排以及核質運輸?shù)取?br>　　冰島硫化葉菌(Sulfolobus islandicus)是一種在北半球廣泛分布的極端嗜酸嗜熱古菌。DExD/H-box解旋酶的存在，對該古菌在極端環(huán)境下的生存起著重要作用，但是對DExD/H-box解旋酶的研究仍然很有限。實驗室前

3、期研究中，得到了冰島硫化葉菌中兩個DExD/H-box解旋酶SiRe_0681與SiRe_1605的基因敲除型菌株，并分析了體內功能，但是敲除菌株的表型分析不夠全面，體外生化實驗也尚未進行。本課題嘗試對冰島硫化葉菌中的兩個DExD/H-box解旋酶SiRe_0681與SiRe1605進行進一步研究。在古菌體內過表達蛋白，測量生長曲線，并檢測敲除菌株在低溫環(huán)境下的生長速率，探索其體內功能。結合轉錄組數(shù)據(jù)分析敲除菌株在有或無MMS損傷劑處理

4、下的轉錄水平變化，分析SiRe_0681與SiRe_1605在細胞內參與的途徑與發(fā)揮的功能。并且在大腸桿菌中表達純化蛋白，初步檢測解旋酶活性。
　　將SiRe_0681與SiRe_1605分別在古菌體內過表達，發(fā)現(xiàn)對菌株的生長沒有明顯的影響。但是在60℃的相對低溫下，ΔSiRe_0681與ΔSiRe_1605兩個敲除型菌株的生長速度都比野生型慢很多，說明DExD/H-box解旋酶對冷脅迫下S.islandicus的生存起著重要作用

5、。之前的研究中發(fā)現(xiàn)，ΔSiRe_0681在最適溫度75℃下的生長速度比野生型REY15A要快，流式細胞分析表明敲除SiRe_0681可能跳過了一些G1/S期的核酸加工修飾過程，導致細胞進程加快。但是當在相對低溫條件下，細胞生長速度卻減慢了很多，說明這些SiRe_0681所調節(jié)的核酸加工修飾可能對細胞應對低溫脅迫有很大幫助，有利于嗜熱菌在更廣泛的溫度中生存。SiRe_1605的缺失同樣導致了低溫下細胞生長速度的減慢，而且敲除SiRe_16

6、05會導致細胞在MMS損傷劑處理下更容易發(fā)生聚集。說明SiRe_1605可能參與基因修復，對于細胞遭受到冷脅迫或者損傷時，都會發(fā)揮重要的作用。
　　轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，MMS處理后ΔSiRe_0681中與細胞分裂相關的基因全部出現(xiàn)上調。反向旋轉酶(reverse gyrase)對極端嗜熱菌在高溫下生存非常重要，反向旋轉酶在ΔSiRe_0681中顯著上調，在ΔSiRe_1605中卻表現(xiàn)出顯著下調，說明其對二者在MMS損傷劑處理下分別

7、表現(xiàn)出的生長加快與生長減慢現(xiàn)象有一定的影響。MMS處理后ΔSiRe_1605中與基因修復、DNA復制、轉錄相關的基因都發(fā)生了下調，說明SiRe_1605參與細胞的損傷修復途徑，缺失后導致細胞面對損傷壓力加大，不得不減慢生長速度來爭取時間修復。根據(jù)總體轉錄水平的上下調以及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，敲除SiRe_1605對細胞內的基因表達水平以及代謝通路的影響比敲除SiRe_0681要大，說明SiRe_1605還可能參與許多細胞中的代謝通路以及

8、表達調控過程。
　　在轉錄組數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，由于兩個解旋酶SiRe_0681與SiRe_1605的基因敲除，導致一段連續(xù)區(qū)域的轉錄水平為0，這種特殊的現(xiàn)象可能與DExD/H-box解旋酶對基因沉默機制的調節(jié)有關。
　　在大腸桿菌中表達SiRe_0681，并使用熱處理與鎳柱親和層析的方法進行了純化。SiRe_1605蛋白表達時容易形成沉淀，而且可能會從序列中間起始翻譯同時表達多個蛋白，難以純化。嘗試改進表達純化條件，更換載體，