參與DNA損傷應答的果蠅miRNA的系統(tǒng)鑒定及其調節(jié)凋亡功能的初步研究.pdf

1、維持基因組的穩(wěn)定性對細胞和組織發(fā)揮正常功能至關重要[1]。每天，人體內每個細胞在內源和外源因素作用下可發(fā)生多至105個DNA損傷。為了應對這些損傷，機體進化出復雜的系統(tǒng)來識別DNA損傷，停止細胞周期進程，調節(jié)細胞新陳代謝，修復DNA損傷，并在損傷不能修復時誘導細胞程序性死亡等。這一系列信號調控通路被稱為DNA損傷應答通路[2,3]。如果DNA損傷不能及時、正確的被修復，會導致堿基突變或染色體的畸變，并最終導致腫瘤等惡性疾病的發(fā)生。嚴重的

2、DNA損傷也可導致細胞死亡或細胞的衰老。在DNA損傷應答調控中，許多DNA損傷應答相關蛋白可以被磷酸化、泛素化、蘇素化、甲基化和乙酰化等修飾調節(jié)[4,5]。除了多種酶對DNA損傷應答相關蛋白的修飾調節(jié)外，DNA損傷后，非編碼 RNA包括微小非編碼 RNA(miRNAs)和長鏈非編碼 RNA(lncRNAs)也可以通過對靶基因進行轉錄后調節(jié)參與 DNA損傷應答[6]。miRNA是一類長度在22個核苷酸左右的非編碼RNA。早期研究指出，敲低

3、miRNA生成和功能發(fā)揮必須的dicer基因和ago2基因后，DNA損傷后細胞的生存率和細胞周期檢測點阻滯水平會顯著降低[7,8]。miRNA發(fā)揮功能的主要方式是通過堿基互補配對與靶基因mRNA結合，從而導致靶基因mRNA降解或mRNA翻譯終止。DNA發(fā)生損傷時，miRNA可以直接調節(jié)DNA損傷應答相關蛋白的表達調節(jié)DNA損傷修復進程，也可以通過調節(jié)包括p53、E2F在內的轉錄調控因子的表達來調節(jié)DNA損傷修復進程。
　　本研究收

4、取了野生型果蠅w1118與p53突變果蠅p535A-1-42-4小時胚胎，使用4 Gy輻照處理，提取總RNA，寄送公司進行RNA-seq分析差異表達的miRNA。通過該策略，共鑒定發(fā)現了44個差異表達的miRNA；使用qPCR方法，U6 RNA作為內參，對隨機選出10個miRNA，包括6個上調的miRNA（miR-263b，miR-137，miR-34，miR-375，miR-987，miR-284）和4個下調的miRNA（miR-10

5、02，miR-2b-2，miR-7，miR-3）的RNA-seq結果進行了驗證，結果顯示 qPCR結果與 RNA-seq結果趨勢一致，進一步證實RNA-seq結果真實可信。由于超過70%的果蠅miRNA已建立突變動物，本實驗室由Bloomington果蠅株共享中心獲得了30株miRNA突變的果蠅株，對其中的19株純合存活果蠅進行了 DNA損傷敏感性檢測。檢測結果顯示，10株miRNA突變果蠅對DNA損傷敏感，2株抵抗，7株與野生型果蠅沒

6、有差異。使用caspase-3染色，對10株輻照敏感的miRNA突變果蠅的翅膀胚芽組織（Wing Disc）進行檢測，觀察miRNA突變對DNA損傷誘導的細胞凋亡的影響。結果發(fā)現，輻照導致7株 miRNA突變果蠅的凋亡水平顯著提升。使用分析軟件 microRNA（http://www.microrna.org）和 TargetScan（http://www.targetscan.org）對miRNA的靶基因進行預測，發(fā)現果蠅促凋亡基因家