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文檔簡介
1、研究背景:
腫瘤細胞放化療抵抗??蓪е履[瘤預后不良。Aurora-A激酶(Aurora-A)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,與有絲分裂的紡錘體分離,中心體復制相關,且在多種腫瘤中均高表達,是一種重要的癌基因。近期研究表明Aurora-A可促進腫瘤放化療抵抗,由于Aurora-A與p53,BRCA1,BRCA2等多種DNA損傷應答蛋白有著相互作用,因此我們推測Aurora-A很可能通過調(diào)節(jié)DNA損傷應答促進腫瘤放化療抵抗。
2、研究目的:
研究Aurora-A與DNA損傷應答的關系,揭示Aurora-A促進腫瘤放化療抵抗的機理,探尋Aurora-A相關腫瘤的新型靶向藥物分子,以期達到腫瘤治療的最佳效果。
材料和方法:
第一部分.觀察Aurora-A對細胞增殖的影響。
1).在乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌細胞中選擇Aurora-A低表達的細胞系(MCF-7,PANC-1和OVCA420),和Aurora-A高表達的細胞系(MDA
3、-MB-231,BXPC3和OVCA429),通過反轉(zhuǎn)錄病毒法轉(zhuǎn)入或沉默Aurora-A。
2).通過細胞計數(shù)和軟瓊脂克隆形成試驗分別繪制細胞生長曲線和克隆形成率柱狀圖。
3)用流式細胞術檢測細胞周期進展。
第二部分.檢測Aurora-A對腫瘤放化療抵抗的影響。
1).用放射線,順鉑或者Aurora-A抑制劑VX680處理細胞后,通過流式細胞術檢測細胞凋亡水平。
2).用MTT檢測順鉑處
4、理后的細胞活力,并計算細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。
第三部分.探究Aurora-A引起腫瘤放化療抵抗的機理
第一章.檢測Aurora-A與DNA損傷應答的關聯(lián)
1).免疫熒光檢測Aurora-A與γ H2AX的關聯(lián)。
2).免疫印跡檢測Aurora-A對DNA損傷應答蛋白(ATM, Chk2,ATR,Chk1,RAD51,H2AX,γ2AX,ERCC2,p53,pp53,AKT1,AKT2)的影
5、響。
第二章.檢測ATM抑制劑對腫瘤放化療抵抗和DNA損傷應答的影響。
1).用ATM抑制劑KU-55933處理細胞,然后用流式細胞術檢測細胞凋亡水平。
2).用免疫印跡檢測ATM抑制劑對DNA損傷應答蛋白(pp53,Chk2,γH2AX,RAD51等)的影響。
第三章.檢測BRCA1/2與Aurora-A之間的關系,并研究BRCA1/2對腫瘤放化療抵抗的影響以及與DNA損傷應答之間的關聯(lián)。
6、> 1).在乳腺癌,胰腺癌和卵巢癌細胞中選擇Aurora-A低表達的細胞系(MCF-7,PANC-1和OVCA420),以及Aurora-A高表達的細胞系(MDA-MB-231,BXPC3和OVCA429),通過反轉(zhuǎn)錄病毒法或Fugene6轉(zhuǎn)染試劑使細胞沉默或者過量表達BRCA1/2。
2).用免疫印跡檢測BRCA1/2與Aurora-A之間的關聯(lián)。
3).通過細胞計數(shù)和軟瓊脂克隆試驗分別繪制細胞生長曲線和克隆形成
7、率柱狀圖。
4).用流式細胞術檢測細胞周期進展。
5).細胞放化療處理后用流式細胞術檢測細胞凋亡水平。
6).免疫印跡檢測BRCA1/2對DNA損傷應答蛋白(p53,pp53,ATM,Chk2,RAD51,γH2AX)的影響。
結果:
第一部分
Aurora-A可促進細胞增殖,細胞周期進展和軟瓊脂克隆形成,而Aurora-A沉默可抑制細胞增殖,細胞周期進展和克隆形成。
8、 第二部分
放化療處理后,Aurora-A轉(zhuǎn)入的細胞系凋亡明顯降低,而Aurora-A沉默或者用Aurora-A抑制劑VX680處理的細胞系凋亡明顯增加;順鉑處理后,Aurora-A轉(zhuǎn)入的細胞系IC50增加,而Aurora-A沉默的細胞系IC50降低。
第三部分
第一章.Aurora-A降低了放射后γH2AX灶點形成,且Aurora-A可異常調(diào)節(jié)DNA損傷應答。
第二章.ATM抑制劑可增加放化療引
9、起的腫瘤細胞凋亡,并且影響DNA損傷應答蛋白表達。
第三章.BRCA1/2與Aurora-A負相關,且BRCA1/2可抑制細胞增殖,體外克隆形成和細胞周期進展,并可通過影響DNA損傷應答增加放化療引起的細胞凋亡。
結論:
研究發(fā)現(xiàn),Aurora-A過表達可促進腫瘤細胞增殖,細胞周期進展,軟瓊脂克隆形成,并可直接或者間接通過上調(diào)ATM表達,下調(diào)BRCA1/2表達,調(diào)節(jié)DNA損傷應答,促進腫瘤放化療抵抗;相反的
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