Aurora-A激酶通過(guò)Akt下調(diào)IkappaBα促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存的信號(hào)傳導(dǎo)通路研究.pdf

1、Aurora激酶是近年來(lái)研究較熱的一個(gè)有絲分裂蛋白激酶，它為進(jìn)化上保守的絲/蘇氨酸激酶，參與了中心體的成熟、分離；紡錘體的組裝、穩(wěn)定；染色體的濃集、中板聚合和穩(wěn)定等多種事件。人類(lèi)細(xì)胞中有3種高度相關(guān)的Aurora激酶(A、B和C)，其中Aurora A(Aur-A)激酶異常表達(dá)往往導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)Aur-A在多種實(shí)體腫瘤和血液腫瘤中高表達(dá)，但其在舌癌中的表達(dá)未有報(bào)道。Aurora激酶的小分子抑制劑

2、VX-680以其選擇性強(qiáng)、毒力低的優(yōu)勢(shì)已試用丁非小細(xì)胞肺癌、大腸癌的臨床治療，顯示出此新靶點(diǎn)的優(yōu)越療效。并且，VX-680對(duì)Aur-A具有更特異的阻斷性(Ki=0.6，Aur-B為18，Aur-C為4.6nM)。VX-680能夠通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞正常分裂并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生長(zhǎng)效抗癌作用。但足Aur-A促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存、抑制細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路目前仍不清楚。為此，本研究做了如下探討：
　　 1.Aur-A激酶在TS

3、CC中的表達(dá)
　　 收集了初治的55例舌鱗癌根治術(shù)的手術(shù)標(biāo)本及30例陰性切緣組織作為對(duì)照。用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)了Aur-A蛋白的表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)分析了Aur-A蛋白表達(dá)與TSCC臨床參數(shù)如分期、性別、分化程度等。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察Aur-A激酶蛋白在TSCC中的表達(dá)情況，分析舌癌患者臨床各指標(biāo)間的關(guān)系，為其作為T(mén)SCC治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 2.VX-680抑制TSCC細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋

4、亡的研究
　　 將Aur-A小分子抑制劑VX-680作用于TSCC細(xì)胞株，首先利用免疫細(xì)胞熒光染色的方法觀察VX-680對(duì)紡錘體形成及Histone H3(Serl0)的表達(dá)水平的影響，以明確VX-680對(duì)Aur-A激酶活性的抑制作用。以此為基礎(chǔ)，利用MTT法觀察VX-680對(duì)TSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；利用Annexin V/PI免疫熒光染色及Westemblot檢測(cè)凋亡情況。
　　 本實(shí)驗(yàn)嘗試將Aur-A激酶小分子抑

5、制劑VX-680作用于TSCC細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的影響，以明確該小分子抑制劑靶向治療TSCC的作用。
　　 3.Aurora-A激酶與P13K/A kt通路交聯(lián)調(diào)節(jié)VX-680誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的研究
　　 將VX-680與P13K的激活劑IGF-1或其抑制劑wortmannin單獨(dú)、兩兩或三者聯(lián)合用藥處理細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)及Western blot檢測(cè)磷酸化Akt及其下游靶點(diǎn)磷酸化GSK3(Se

6、r21/9)和IKBa蛋白表達(dá)、凋亡標(biāo)志蛋白如Caspase-3及PARP斷裂帶以探討Aur-A激酶與PI3 K/Akt通路的交聯(lián)關(guān)系。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討Aur-A與P13K之間的交匯關(guān)系對(duì)TSCC細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，為同時(shí)靶向Aur-A和PI3K的聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 4.Au rora-A激酶與P13K/A kt通路交聯(lián)調(diào)節(jié)舌癌細(xì)胞遷移的研究
　　 將VX-680與PI3K的激活劑IGF-1或

7、其抑制劑wortmannin單獨(dú)、兩兩或三者聯(lián)合用藥處理細(xì)胞，利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)TSCC細(xì)胞侵襲的影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討Aur-A與P13K之間的交匯關(guān)系對(duì)TSCC細(xì)胞遷移的影響，為同時(shí)靶向Aur-A和P13K的聯(lián)合用藥提供進(jìn)一步依據(jù)。
　　 5.Akt在VX-680誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞凋亡中的作用研究
　　 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Myr-A kt1和空質(zhì)粒pUSE的細(xì)胞株，首先用Western blo

8、t確認(rèn)了轉(zhuǎn)染效率。用VX-680處理轉(zhuǎn)染Myr-Aktl和pUSE的細(xì)胞，利用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染Myr-Aktl細(xì)胞對(duì)VX-680誘導(dǎo)凋亡的影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討Akt在VX-680誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞凋亡中所起的作用，探索Akt在Aur-A促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的上下游關(guān)系。
　　 6.Aur-A激酶調(diào)控Akt及其下游促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存的信號(hào)傳導(dǎo)通路
　　 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Aur-A，干擾Aur-A或VX-680

9、處理細(xì)胞，利用Westem blot檢測(cè)磷酸化Akt及其下游IKBa蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)NF-KB的靶基因Bcl-xL蛋白表達(dá)；利用免疫細(xì)胞熒光染色的方法檢測(cè)NF-KB亞基P65在胞核和胞漿的表達(dá)情況。更為重要的足，用wortmannin阻斷PI3K，或者用API-2或干擾阻斷Akt后，利用Western blot檢測(cè)Aur-A對(duì)檢測(cè)磷酸化Akt及其下游分子表達(dá)的調(diào)控。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討Aur-A調(diào)控腫瘤細(xì)胞生存的信號(hào)傳達(dá)通路

10、。
　　 本研究研究的結(jié)果及意義總結(jié)如下：
　　 1.首次明確了Aur-A激酶蛋白在初治的接受舌鱗癌根治術(shù)的患者中的表達(dá)，不僅揭示了Aur-A激酶作為一種新的舌癌標(biāo)志物可能與舌癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)，也為其作為分子靶向治療的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。
　　 2.明確了Aur-A激酶小分子抑制劑VX-680能夠劑量及時(shí)間依賴性的抑制TSCC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示出了其對(duì)TSCC細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用；更

11、為重要的是，VX-680與PI3K的小分子抑制劑wortmannin聯(lián)合誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞凋亡具有協(xié)同效應(yīng)。因此，VX-680作為新的分子靶向藥物以其特異性高，效果顯著，毒性低顯示出其在治療舌癌中的光明前景。
　　 3.闡明了VX-680誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，包括：紡錘體單極化、HistoneH3(Ser10)的活性下降、Akt及其下游分子活性下降、PARP剪切、Caspase通路的激活以及下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)