USP19在DNA雙鏈損傷應(yīng)答中的功能及機制研究.pdf

1、細胞周期的正常運行，尤其是有絲分裂期的一系列復(fù)雜而精細事件的調(diào)控，是保證基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵[1]。遺傳物質(zhì)經(jīng)過復(fù)制和有絲分裂期的染色體的正確分離，平均地分給子代細胞。當(dāng)DNA發(fā)生損傷，正常細胞可以激活相應(yīng)的周期檢查點，延緩或阻滯有絲分裂進程并啟動修復(fù)，待修復(fù)正確完成才繼續(xù)分裂[2，3];如果檢查點失去正常功能或修復(fù)機制缺陷，受損遺傳物質(zhì)帶著錯誤進入有絲分裂，傳到子代細胞，就引入了突變，突變隨著有絲分裂而累積，從而引起基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)

2、致腫瘤的發(fā)生[4-7]。
　　DNA雙鏈斷裂是最嚴重的一種DNA損傷，如果不得到修復(fù)，細胞將面臨染色體斷裂和死亡，不正確的修復(fù)又可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。細胞為了應(yīng)對雙鏈斷裂，主要有兩條修復(fù)途徑:同源重組和非同源末端連接，共同維持細胞的基因組穩(wěn)定[1，9-12]。DNA損傷是腫瘤治療的常用手段，因此，DNA修復(fù)在腫瘤治療中至關(guān)重要。DNA修復(fù)缺陷會導(dǎo)致細胞對DNA損傷高度敏感[13]，但當(dāng)DNA修復(fù)能力異常增強，則導(dǎo)致腫瘤耐受DN

3、A損傷刺激，即產(chǎn)生耐藥[14，15]。同時，DNA修復(fù)缺陷的生物個體經(jīng)常有各種遺傳病癥，通常隨著年齡的增長有極高的罹患癌癥的幾率。因此，以DNA修復(fù)作為靶點，是腫瘤臨床輔助治療的重要思路[16]。
　　本項工作利用siRNA基因沉默高通量篩選平臺，結(jié)合Time-lapse活細胞實時成像技術(shù)，篩選調(diào)控有絲分裂的新功能蛋白。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP19參與調(diào)控細胞有絲分裂，敲低USP19表達導(dǎo)致腫瘤細胞在有絲分裂后期出現(xiàn)染色體錯誤分離(ch

4、romosomemis-segregation)的比率升高，形成“染色體橋”和“微核”，提示細胞的DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)機制失常。同時，持續(xù)增加的染色體錯誤分離比率是導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生的重要因素之一[17，18]。
　　USP19是泛素特異性加工酶（ubiquitin-specific processing enzymes，UBPs或USPs），屬于去泛素化酶的一員，在組織中廣泛表達。USP19能水解底物蛋白上的泛素鏈的鏈

5、接，起到去泛素化的作用。USP19在缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肌肉萎縮、細胞增殖中發(fā)揮一定作用[19-21]，目前對USP19沒有關(guān)于DNA損傷及修復(fù)方面的任何報道，但是磷酸化蛋白質(zhì)組的大規(guī)模篩選鑒定到USP19有DNA損傷相關(guān)的磷酸化位點，因此，深入研究USP19參與DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)的功能及分子機制有其重要意義。
　　在此基礎(chǔ)上，為了確證USP19蛋白質(zhì)在維持染色體穩(wěn)定性中的作用，展開了初步探索，研究結(jié)果如下:
　　(1)在蛋

6、白水平檢測發(fā)現(xiàn)USP19受電離輻射誘導(dǎo)表達上調(diào)，表明USP19可能在DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮一定的功能。
　　(2)為了驗證USP19是否能被ATM/ATR磷酸化[22]，外源轉(zhuǎn)染Flag-USP19后，用Flag beads富集UV或IR處理前后的Flag-USP19，以特異性識別phospho-SQ/TQ的抗體孵育，發(fā)現(xiàn)在UV或IR輻射處理后USP19確實被磷酸化，而且它的磷酸化會被PIKK抑制劑wortmannin抑制，說明US

7、P19的激酶屬于PIKK激酶。
　　(3)敲低USP19的蛋白表達，檢測IR輻射后DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)多個損傷反應(yīng)蛋白的磷酸化水平降低，包括p-Chk1(Ser317)，p-Chk2(Thr68)，p-KAP1(Ser824)及γ-H2AX，輻射后檢查點導(dǎo)致的G2/M阻滯也有延后，這些結(jié)果表明USP19對DNA損傷應(yīng)答具有重要作用;
　　(4)HR和NHEJ修復(fù)報告系統(tǒng)提示，敲低USP19表達后HR和NHEJ修

8、復(fù)能力都有上調(diào)，尤其是NHEJ修復(fù)途徑，提示USP19參與調(diào)控雙鏈斷裂的修復(fù)?！叭旧w橋”的成因就是染色體末端通過NHEJ途徑融合，敲低的USP19“染色體橋”增多，和敲低后NHEJ途徑增強，是具有一致性的。同時，敲低USP19后細胞DNA修復(fù)能力變強可能與腫瘤細胞耐藥的機制有關(guān);
　　(5)細胞內(nèi)源相互作用數(shù)據(jù)庫提示USP19與HDAC1和HDAC2可能存在于一個功能復(fù)合體內(nèi)[23]，通過co-IP，我們驗證了USP19與HDA

9、C1和HDAC2確實存在相互作用。已有多篇文獻報道HDAC1和HDAC2能促進DNA雙鏈斷裂修復(fù)，尤其是非同源末端連接，這提示USP19可能部分通過HDAC1和HDAC2發(fā)揮其在DNA修復(fù)方面的功能;
　　(6)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)USP19在卵巢癌和頭頸癌中存在缺失，提示USP19對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
　　綜上所述，我們對USP19參與調(diào)節(jié)DNA損傷及修復(fù)的機制進行了推想，一方面USP19可能通過調(diào)控DDR相關(guān)蛋白的修飾而