家蠶主要協(xié)助轉運蛋白基因BmMFS的研究.pdf

1、膜蛋白在生物體的生命活動中不可或缺，主要承擔細胞內(nèi)外環(huán)境物質和能量的交換。大多數(shù)的藥物以膜蛋白為靶點，因此解析膜蛋白的結構對于藥物設計起著非常重要的作用。然而膜蛋白由于天然含量低，分離提純困難以及克隆表達的缺陷等因素導致研究進展緩慢。主要協(xié)助轉運蛋白超家族（majorfacilitatorsuperfamily，MFS）是一個主要的次級膜轉運蛋白超家族。由于轉運底物的多樣性，使得它們在細胞能量代謝和物質交換過程中起重要作用。MFS超家族

2、在低等生物和高等生物中廣泛存在，成員眾多。由于膜蛋白的結構解析存在很多困難，到目前為止，只有5種MFS蛋白結構被解析清楚，且全部來源于細菌。家蠶中未見該蛋白的相關報道。多角體蛋白(Polyhedrin，Polh)是昆蟲桿狀病毒感染昆蟲后晚期高效表達的一種結構蛋白，分子量約為29kD，其形成的包涵體可在pH10.8以上的緩沖液中溶解。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，多角體蛋白自N端起的20個氨基酸殘基的片段(Ph20)保留了多角體晶體的部分特性，在pH

3、值回調(diào)至8.0時融合蛋白依然存在于上清中。利用這種特性，可將外源基因與Ph20基因融合表達，通過調(diào)節(jié)pH簡單純化目的蛋白。
　　在本實驗室家蠶蛹cDNA文庫中篩選到一條ORF為915bp的序列，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白含有304個氨基酸殘基，是一個含有六個跨膜區(qū)的蛋白，包含一個MFS保守結構域，將其命名為BmMFS。構建重組質粒pET-32a-Ph20-BmMFS，在Ph20和BmMFS基因中間引入凝血酶(Thromb

4、in)酶切位點的核酸序列。轉化E.coliRosetta，1mMIPTG誘導融合蛋白表達。利用Ph20的溶解特性通過調(diào)節(jié)pH進行初步純化，鎳柱親和層析進一步純化，經(jīng)Westernblotting和質譜鑒定該融合蛋白為Ph20-BmMFS。利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)構建重組病毒vPh20-BmMFS，感染家蠶BmN細胞，細胞發(fā)病后經(jīng)Westernblotting檢測，結果顯示融合蛋白成功表達。熒光定量PCR結果顯示，BmMFS基因在家蠶五齡