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文檔簡介
1、家蠶繭中的色素來自桑葉,經(jīng)蠶食下后,由中腸上皮細(xì)胞吸收,通過中腸進(jìn)入血淋巴,最后進(jìn)入絲腺,在絲膠層積累,使繭絲著色。由于繭絲中色素的種類,含量和分布的不同,產(chǎn)生了各種繭色。家蠶黃紅繭系形成主要色素為類胡蘿卜素,包括葉黃素,β-胡蘿卜素,α-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)。對黃紅繭系中繭色形成研究比較深入的是黃繭形成機(jī)理,黃繭中主要色素是葉黃素,其次是β-胡蘿卜素,涉及Y,I,C三個基因的調(diào)控。Y基因為黃血基因,控制中腸上皮細(xì)胞對類胡蘿卜素的吸收,可使
2、血液著色;I基因為黃血抑制基因,控制類胡蘿卜素由中腸到血液的轉(zhuǎn)運;C基因控制類胡蘿卜素由血液進(jìn)入絲腺,使絲腺著色。Y,I,C分別對+Y,+I,+C為顯性。只有Y+IC的基因組合才能形成黃色繭,其中Y基因編碼CBP,Cameo2受C基因控制。
CBP序列中含一個START結(jié)構(gòu)域,CBP蛋白能與葉黃素以1:1的摩爾比結(jié)合。在哺乳動物中,START結(jié)構(gòu)域與膽固醇,磷脂酰膽堿,神經(jīng)酰胺,葉黃素等多種脂類物質(zhì)的結(jié)合及代謝相關(guān)。傳統(tǒng)遺
3、傳分析認(rèn)為Y基因主要是控制家蠶的中腸類胡蘿卜素的吸收,而新的研究表明Y基因產(chǎn)物CBP,在黃繭N4品種的中腸和絲腺均有蛋白表達(dá),即其可能在中腸和絲腺均與類胡蘿卜素的吸收轉(zhuǎn)運有關(guān)。此外,Y基因在黃紅繭系多種繭色的形成中起關(guān)鍵作用,可能涉及不同類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)運調(diào)控,因此,CBP也可能與多種類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運相關(guān)。
Cameo2為CD36基因家族基因,與哺乳動物SR-BⅠ和果蠅ninaD同源。SR-BⅠ在哺乳動物中作為高密度脂蛋白受體
4、,參與膽固醇,葉黃素,玉米黃素,β-胡蘿卜素,維生素E等多種脂類的吸收轉(zhuǎn)運。ninaD在果蠅細(xì)胞中參與細(xì)胞對葉黃素,玉米黃素,β-胡蘿卜素的吸收。Cameo2在中腸和絲腺均有mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
Y基因產(chǎn)物CBP和C基因產(chǎn)物Cameo2在家蠶類胡蘿卜素選擇性轉(zhuǎn)運的兩個關(guān)鍵部位,中腸和絲腺均有蛋白表達(dá)或mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá),他們的同源基因或保守結(jié)構(gòu)域在其他物種中都與脂類的轉(zhuǎn)運密切相關(guān),Y基因又在黃紅繭系多種繭色形成過程中扮演關(guān)鍵作
5、用,那么在黃繭家蠶主要繭色色素(葉黃素和β-胡蘿卜素)轉(zhuǎn)運過程中,CBP和Cmaoe2是否單獨能夠行使吸收轉(zhuǎn)運功能?兩者在類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)運過程中是否存在協(xié)同作用?如果存在協(xié)同作用關(guān)系,兩者是否具有蛋白質(zhì)問的相互作用?Cmaoe2基因組上的同源串聯(lián)基因Cameo1是否也與類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運有關(guān)?本文針對以上問題,進(jìn)行研究,得到了以下研究結(jié)果。
1.Cameo1,Cameo2與CBPmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)與家蠶葉黃素轉(zhuǎn)運相關(guān)性
6、 取不同繭色品種家蠶繭色形成關(guān)鍵時期的組織,末齡3-6天的中腸和絲腺,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR檢測Cameol,Cameo2與CBP的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)與葉黃素轉(zhuǎn)運相關(guān)性。
結(jié)果顯示,以葉黃素為主要繭色形成色素的家蠶品種(03-210、柬埔寨和02.320)中,Cameol,Cameo2與CBPmRNA在中腸和絲腺中同時轉(zhuǎn)錄,在其他不是以葉黃素為主要繭色形成色素的家蠶品種(03-520、大造和秋白)中,
7、Cameol,Cameo2與CBP不是同時在中腸和絲腺中轉(zhuǎn)錄,暗示Cameol,Cameo2與CBP這3個基因可能同時參與家蠶黃紅繭形成過程中葉黃素在中腸和絲腺的轉(zhuǎn)運。
2.家蠶類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白在細(xì)胞水平對類胡蘿卜素吸收轉(zhuǎn)運的影響
將Cameo1,Cameo2,CBP,cbp(CBP缺失型)分別構(gòu)建真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,對其進(jìn)行細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,Cameo1和Cameo2定位在細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)
8、域,CBP和cbp則分布在整個細(xì)胞。在單獨轉(zhuǎn)染和組合共轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別與含有葉黃素和β-胡蘿卜素微粒的培養(yǎng)液孵育后,收集并破碎細(xì)胞,提取類胡蘿卜素,HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素含量。檢測結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示,共表達(dá)Cameo2+CBP細(xì)胞葉黃素積累量是表達(dá)EGFP對照組的2.71倍,差異極顯著(P=0<0.01),且細(xì)胞葉黃素積累量具飽和性和濃度依賴性特點,這表明共表達(dá)Cameo2+CBP細(xì)胞對葉黃素的轉(zhuǎn)運為
9、細(xì)胞載體介導(dǎo)。表達(dá)以上蛋白的細(xì)胞,與表達(dá)EGFP對照組相比,細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量并無顯著差異(P>0.05),表明以上幾種蛋白對β-胡蘿卜素沒有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運功能。
3.家蠶類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白相互作用的初步檢測
運用BiFC(雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)),將Cameo1和Cameo2分別構(gòu)建到載體pBiFC-VC155(HA-CMVbackbone)上,CBP和cbp分別構(gòu)建到載體pBiFC-VN173(FLAG-
10、CMVbackbone)上,然后將Cameo1與CBP,Cameo2與CBP,Cameo1與cbp,Cameo1與cbp組合,共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察顯示CBP與Cameo1,CBP與Cameo2在細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域可能有蛋白相互作用或者空間上的相互靠近。
綜合RT-PCR實驗,瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞色素孵育實驗和BiFC實驗結(jié)果,得出以下結(jié)論:Cameo2與CBP在可能同時在家蠶中腸和絲腺參與葉黃素的轉(zhuǎn)運;Ca
11、meo2與CBP在細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域可能具有蛋白間相互作用或者空間上的相互靠近;兩者可協(xié)同作用將葉黃素跨膜轉(zhuǎn)運,由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)。
我們推測在色素轉(zhuǎn)運過程中,Cameo2可能在細(xì)胞膜上起“捕獲”葉黃素的作用,葉黃素隨后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi),傳遞給細(xì)胞內(nèi)的葉黃素結(jié)合蛋白CBP,使其在細(xì)胞內(nèi)直接行使生理功能、積累或者進(jìn)一步轉(zhuǎn)運;Cameo2和CBP在細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域的相互作用或者空間上的相互靠近可能起到傳遞脂類(葉黃素)的作用;在家蠶黃繭
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