UCH-L1對HDAC6介導的tau蛋白功能性聚集體形成的影響.pdf

1、泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑是細胞內(nèi)降解異常蛋白質(zhì)的主要途徑，它們監(jiān)測、調(diào)控胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，并能及時清除異常蛋白質(zhì)。與tau蛋白相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病常表現(xiàn)為tau蛋白的異常修飾和在胞內(nèi)的大量聚集，并且伴隨著泛素-蛋白酶體降解途徑功能障礙，不能有效清除胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)，同時UCH-L1也會發(fā)生功能障礙。此時，自噬-溶酶體途徑的活性會增加，異常蛋白質(zhì)降解的代償性途徑發(fā)揮降解異常蛋白質(zhì)功能。自噬-溶酶體途徑不僅需要HDAC6、p62和

2、動力蛋白等蛋白質(zhì)分子，還需要ataxin3和Poh1等去泛素化酶的參與。并且，HDAC6也可以與去泛素化酶UCH-L1結(jié)合，但UCH-L1的具體作用以及是否會影響自噬-溶酶體途徑尚未得知。
　　本實驗中，首先誘導HEK293/tau441細胞產(chǎn)生去泛素化酶UCH-L1表達異常和蛋白酶體功能障礙，即采用UCH-L1 siRNA抑制UCH-L1表達后，同時用2μM的MG132處理HEK293/tau441細胞24hr。隨后采用West

3、ern Blot檢測細胞內(nèi)HDAC6和總tau蛋白含量的變化情況，用免疫沉淀檢測HDAC6與泛素化tau蛋白結(jié)合的變化情況，以及用免疫熒光檢測實驗處理后各處理組tau蛋白功能性聚集體的形成情況。實驗結(jié)果表明:(1)與對照組相比，UCH-L1 siRNA能抑制UCH-L1表達（抑制率為75％）;用MG132處理后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)HDAC6和總tau蛋白水平增加;(2)UCH-L1 siRNA和MG132同時處理細胞，與MG132組相比，HDAC

4、6表達下調(diào)，總tau蛋白含量上升;(3)免疫沉淀結(jié)果顯示，與對照組相比，MG132處理后，細胞內(nèi)多聚泛素含量增加，泛素化tau蛋白含量增多，HDAC6與泛素的結(jié)合增加;(4)免疫沉淀結(jié)果顯示抑制UCH-L1正常表達并抑制蛋白酶體活性后，與MG132實驗組相比，細胞內(nèi)泛素化tau蛋白含量繼續(xù)增加，然而，HDAC6和泛素的結(jié)合下降;(5)免疫沉淀結(jié)果顯示，與對照組相比，MG132處理后，胞內(nèi)HDAC6與tau-5結(jié)合顯著增加，同時抑制UCH

5、-L1表達后，HDAC6與tau-5結(jié)合也表現(xiàn)為增加，但與MG132組相比表現(xiàn)為顯著下降;(6)免疫熒光結(jié)果顯示，MG132處理則能促使細胞內(nèi)形成明顯的tau蛋白聚集體結(jié)構(gòu)，但是UCH-L1表達下降并抑制蛋白酶體活性后，tau蛋白雖然表現(xiàn)出一定的聚集趨勢，但未能形成功能性聚集體結(jié)構(gòu)。結(jié)論:上述結(jié)果表明蛋白酶體活性被MG132抑制后，胞內(nèi)異常tau蛋白會形成聚集體經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解，以減少對細胞的毒性作用;若同時抑制去泛素化酶UCH-