簡(jiǎn)介：簟781455碩士學(xué)位論文2005屆人B7一H3分子的克隆、表逮及其生物學(xué)功能的初步研究CLONE，EXPRESSIONOFHUMANB7一H3ANDTHESTUDYOFITSBIOLOGICALFUNCTIONS／NVITRO研究生姓名指導(dǎo)教師姓名申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別專業(yè)名稱研究方向論文提交日期張光波張學(xué)光醫(yī)學(xué)碩士免疫學(xué)細(xì)胞免疫2005年5月人B7H3分子的克隆、表達(dá)囂其生物學(xué)功能的初步研究中文摘要因細(xì)胞株L929／B7．H3。利用上述構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929／B7．H3為免疫原，免疫BALB／C小鼠，采用B淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，將反復(fù)免疫后的小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行細(xì)胞融合，以此轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞L929／MOCK作為陰性對(duì)照細(xì)胞，篩選特異性分泌鼠抗人B7．H3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人B7．H3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4H7和21D4。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，4H7和21D4的重鏈均為IGGL而輕鏈均為K。以L929／B7．H3為競(jìng)爭(zhēng)靶細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)顯示，4H7和21D4識(shí)別不同的抗原位點(diǎn)。利用自行研制的兩株鼠抗人B7．H3單克隆抗體，采用免疫熒光標(biāo)記及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)綜合分析B7一H3在腫瘤細(xì)胞株、外周血淋巴細(xì)胞上的蛋白表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B7．H3在幾乎所有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株上都有著高水平的表達(dá)，而在其他來(lái)源的細(xì)胞株上都未檢測(cè)到B7．H3分子的表達(dá)；在靜止及活化后的B、T淋巴細(xì)胞上都未見(jiàn)B7．H3的表達(dá)，但B7．H3可穩(wěn)定表達(dá)在未成熟、成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的DCS上。單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS、GM．CSF等刺激下，也可檢測(cè)到B7．H3的表達(dá)。同時(shí)分析了B7．I13在上皮來(lái)源的腫瘤新鮮組織上的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，在檢測(cè)的多數(shù)標(biāo)本上并未檢測(cè)到B7．H3的表達(dá)，但在癌旁組織呈現(xiàn)B7H3的表達(dá)。3．B7．1T3生物學(xué)功能的初步研究采用PCR的方法，將B7．H3胞外段基因和人IGGLFC段基因連接后，裝入真核表達(dá)載體PGEZ．TERM。重組載體PGEZ．TERM／B7．H3IG質(zhì)粒與兩個(gè)輔助病毒載體脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，用含有完整病毒顆粒的293T細(xì)胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)L929細(xì)胞，使其被病毒感染，加入選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑選出穩(wěn)定表達(dá)B7．H3IG融合蛋白的L929細(xì)胞株。無(wú)血清培養(yǎng)上清經(jīng)PROTEING柱純化后，所得的蛋白行SDS．PAGE電泳呈現(xiàn)一條分子量約66KD的條帶且能該蛋白可被抗B7H3抗體識(shí)別。將反應(yīng)T細(xì)胞經(jīng)激發(fā)型CD3單抗及B7．H3IG聯(lián)合刺激后，共培養(yǎng)3D。3HTDR摻入法顯示，B7．H3IG融合蛋白能有效地促進(jìn)T細(xì)胞增殖，且存在劑量依賴性。ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子表明，該融合蛋白能明顯促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)ILLO和IFNY的分泌。以上結(jié)果提示B7H3能在體外有效的介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、IL．10和IFNO的分泌。H

簡(jiǎn)介：蘭州大學(xué)博士學(xué)位論文食管間質(zhì)瘤的分子生物學(xué)和臨床特征及其外科治療的研究姓名蔣鵬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)胸外科指導(dǎo)教師高秉仁赫捷20100501蘭州大學(xué)博士研究生學(xué)位論文外顯子13和外顯子17以及PDGFRA基因的外顯子12和外顯子18的突變情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果從63例食管間葉源性腫瘤中確診了8例食管間質(zhì)瘤食管間質(zhì)瘤約占同期食管間葉源性腫瘤的12．7％。在這8例患者中，男女性別之比為53，患者發(fā)病的中位年齡為57歲，吞咽困難是最常見(jiàn)的癥狀。病變位置都在食管下三分之一段，其中5例發(fā)生在食管下段和胃食管交界處。所有患者都接受了手術(shù)治療，手術(shù)方式有兩種單純病變摘除術(shù)和食管大部切除、胃食管吻合術(shù)。術(shù)后病理檢查中均未發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)前、術(shù)后均未被診斷為食管間質(zhì)瘤。所有患者術(shù)前、術(shù)后均未接受過(guò)放、化療和甲磺酸伊馬替尼等輔助治療。中位隨訪時(shí)間為59個(gè)月。8例食管間質(zhì)瘤中有4例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，并死于本病，其中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的2例患者均為肝臟轉(zhuǎn)移。8例食管間質(zhì)瘤標(biāo)本中測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)C．KIT基因的EXON11突變兩例，C．KIT基因的EXON9、EXON13、EXON17和PDGFRA基因的EXON12、EXON18均未發(fā)現(xiàn)突變。C．KIT基因的EXON11突變的兩例中，1例為堿基缺失突變558560位密碼子AAG、GTT、GTT缺失，另一例為點(diǎn)突變559位密碼子突變GTTGAT。結(jié)論1食管間質(zhì)瘤是一種比較少見(jiàn)的的食管間葉源性腫瘤，復(fù)發(fā)率和死亡率較高，尤其是腫瘤較大的患者9CM。術(shù)前診斷往往比較困難。2術(shù)后病理組織的免疫組織化學(xué)檢查是食管間質(zhì)瘤診斷與鑒別診斷的先決條件。常用的免疫標(biāo)記物有CDL17，CD34，SMA，S．100等。3外科手術(shù)依然是治療食管問(wèn)質(zhì)瘤的主要的和首選的治療方法。成功的食5

簡(jiǎn)介：TRAIL基因是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員在人體的大多數(shù)器官和組織中都有表達(dá)因此推測(cè)TRAIL分子有著廣泛的功能目前認(rèn)為T(mén)RAIL蛋白可能參與機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、體內(nèi)造血調(diào)節(jié)、巨噬細(xì)胞的平衡維持以及胚胎的免疫豁免成熟的TRAIL蛋白主要以膜結(jié)合或可溶性的形式酆可溶性的TRAIL蛋白是膜結(jié)合蛋白被蛋白酶水解的胞外活性部分為了進(jìn)一步研究TRAIL基因的免疫生物學(xué)功能我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了以下的實(shí)驗(yàn)利用RTPCR技術(shù)我們分別從正常人的外周血淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞株中獲得STRAIL基因并將目的基因插入含有AMP以及LACZ的測(cè)序載體PCR21并將含有目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5Α中進(jìn)行大量擴(kuò)增并鑒定經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)從腫瘤細(xì)胞株中獲得的目的基因序列與GENEBANK完全一致而淋巴細(xì)胞來(lái)源的基因序列的第905位與GENEBANK不同首次報(bào)道了正常人淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的STRAIL基因中的單堿基突變現(xiàn)象

簡(jiǎn)介：該論文以環(huán)境總基因組DNA為研究切入點(diǎn)首先構(gòu)建了海水環(huán)境基因組DNA文庫(kù)在對(duì)己知褐藻膠裂解酶序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物建立了一個(gè)簡(jiǎn)便而有效的褐藻膠裂解酶基因PCR篩選法通過(guò)該方法篩選得到一條褐藻膠裂解酶新基因重組酶具有POLYM底物專一性該研究為實(shí)現(xiàn)褐藻膠的酶法降解奠定了基礎(chǔ)該論文以該ALGL基因?yàn)檠芯壳腥朦c(diǎn)從海水中篩選得到一株高產(chǎn)褐藻膠的海洋假單胞細(xì)菌克隆了褐藻膠生物合成操縱元基因的全序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析由于細(xì)菌褐藻膠生物合成途徑已經(jīng)比較清晰該操縱元全序列的克隆和分析為利用DNA重組技術(shù)改建細(xì)菌固有的褐藻膠生物合成途徑、獲得新型褐藻膠多糖或者寡糖、實(shí)現(xiàn)褐藻膠的生物轉(zhuǎn)化奠定了分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)博士學(xué)位論文中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR雙突變的分子流行病學(xué)及生物學(xué)特性研究姓名張國(guó)淳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師吳一龍20070430LL_L冉I寧竹論上。IⅢ扯小細(xì)胞種艋吉占EGFR“突變的舒F贏J抽卞，乏’L物卞持性研宄I正捕霍突變的分了流IJ病學(xué)研究，了解EGFR雙突變的分布規(guī)律并進(jìn)步通過(guò)仆外實(shí)驗(yàn)明確其生物學(xué)釣性以指導(dǎo)臨床個(gè)體化TKI治療的用藥選擇。方法1非選擇性中國(guó)人NSCLC患者肺癌組織標(biāo)本的EGFR測(cè)序2004年1月至2005年7月期間，“東省人民醫(yī)院腫瘤巾心收治的非小細(xì)H色I(xiàn)肺癌患者，采用TRIZOL法及石蠟包埋組織DNA提取法獲得所有標(biāo)本的皋岡DNA進(jìn)行PCR測(cè)序。除對(duì)EGFR的18，19，21外顯F測(cè)序外，接受過(guò)GEFITMIB治療的病例還進(jìn)行KRAS第2顯子及EGFR笫20外顯子的耐藥性突變榆測(cè)。2EGFR雙突變的等位基因定位實(shí)驗(yàn)提取攜帶EGFR雙突變的肺癌組織的總RNA進(jìn)行EGFRL821外顯F全K的RTPCR，并使用PMDL8T載體進(jìn)行TA克隆測(cè)序，分析EGFR雙突變的等位毖因分卻情況。3EGFR雙突變表達(dá)載體的構(gòu)建利用STRATAGENE公司開(kāi)發(fā)的QUICKCHANGEXL定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑858R定點(diǎn)突變劍己插入了EGFRDELE746一A750的PEDNA31一表達(dá)載體上，從而構(gòu)建EGFRDELE746A750／L858R雙突變表達(dá)載體。通過(guò)雙酶切及EGFR開(kāi)放讀碼柜全長(zhǎng)測(cè)序進(jìn)行鑒定。4TKIS藥敏實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建成功的EGFR雙突變以及DELE746A750，L858R兩種單突變載體與野生型載體通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的方法分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后以分別以GEFITINIB與ERLOTINIB濃度梯度處理3小時(shí)。處理完成后以EGF刺激誘導(dǎo)EGFR磷酸化。收集細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行EGFRTYRL068位點(diǎn)磷酸化的WESTERNBLOTTING檢測(cè)。使用QUANTITYONE光密度分析軟件對(duì)WESTERNBLOTTING的結(jié)果進(jìn)行分析，獲得EGFR磷酸化被TKIS抑制程度的比值，并作圖比較。5EGFR雙突變體對(duì)P13K／AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路效應(yīng)的初步研究將上述4種EGFR表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞提取總RNA行P13K及AKT兩種基因的災(zāi)時(shí)熒光定量PCR，并比較4種轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中以EGFR轉(zhuǎn)錄水平校正后的這柏種基因轉(zhuǎn)錄水平，初步了解EGFRⅡ

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多大鼠腎移植后肝組織中凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的分子生物學(xué)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：呼吸道合胞病毒RESPIRATYSYNCYTIALVIRUSRSV簡(jiǎn)稱合胞病毒是重要的嬰幼兒急性呼吸道感染病原體可引起間質(zhì)性肺炎及毛細(xì)支氣管炎等疾病。RSV感染非常普遍超過(guò)90％的兒童在2歲以前感染過(guò)RSV而且都經(jīng)歷過(guò)1次或多次感染。在發(fā)展中國(guó)家5歲以下兒童因RSV感染住院病人的死亡率為7％發(fā)達(dá)國(guó)家為05％20％。我國(guó)RSV感染研究缺乏全國(guó)資料部分地區(qū)資料顯示北京市兒童醫(yī)院研究顯示在19961999年期間住院的病人中有呼吸道感染癥狀病例1183例RSV陽(yáng)性者標(biāo)本255例占送檢標(biāo)本總數(shù)的215％沈陽(yáng)地區(qū)19992000年調(diào)查顯示小兒急性呼吸道感染病例的4462％由RSV引起。我省尚未開(kāi)展RSV感染的病原學(xué)研究?jī)H僅開(kāi)展了RSVIGM抗體的檢測(cè)工作也沒(méi)有對(duì)于嬰幼兒急性呼吸道感染病例的病原學(xué)流行趨勢(shì)的研究。為了了解河南省嬰幼兒急性呼吸道感染病例病原學(xué)分布狀況探討呼吸道合胞病毒在我省的流行規(guī)律積累呼吸道合胞病毒毒株了解呼吸道合胞病毒黏附蛋白G基因的分子生物學(xué)特征確定我省呼吸道合胞病毒分離株的型別從而填補(bǔ)我省呼吸道合胞病毒病原學(xué)研究的空白我們?cè)O(shè)立并開(kāi)展了此項(xiàng)研究工作。另外通過(guò)對(duì)呼吸道合胞病毒各種檢測(cè)、鑒定方法的對(duì)比比較各種檢測(cè)方法檢測(cè)效果的差異在尋找呼吸道合胞病毒快速檢測(cè)方法、建立應(yīng)急檢驗(yàn)平臺(tái)等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的預(yù)防控制工作方面提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。材料與方法研究對(duì)象來(lái)源于2006年10月2007年5月期間河南省人民醫(yī)院兒科門(mén)診和住院病例以及河南省流感樣病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中的病例對(duì)診斷為急性支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎、肺炎符合篩選條件的病例確定為研究對(duì)象。對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)查并采集咽拭液標(biāo)本選擇HEP2、VERO細(xì)胞系采用組織培養(yǎng)的方法在咽拭液標(biāo)本中分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒株運(yùn)用相關(guān)試劑盒提取咽拭液標(biāo)本RNA模板采用AGELISA、REALTIMEPCR等方法鑒定呼吸道合胞病毒。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)RSV黏附蛋白G基因的上下游引物對(duì)鑒定陽(yáng)性病例運(yùn)用RTPCR方法擴(kuò)增該基因陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用核苷酸測(cè)序方法獲得G基因全長(zhǎng)核苷酸序列將所獲得的序列與已知參考毒株G基因序列一同導(dǎo)入DNASTAR軟件進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)等相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較各檢測(cè)方法的敏感性差異結(jié)合實(shí)際工作找出快速實(shí)用的檢測(cè)方法。結(jié)果通過(guò)收集和篩選資料共有126例病例符合本研究所規(guī)定的條件對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)查和采集臨床標(biāo)本共采集咽拭液標(biāo)本126份。經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)共有58份標(biāo)本出現(xiàn)CPE其中5份為典型細(xì)胞融合病變53份為其他細(xì)胞病變。經(jīng)過(guò)REALTIMEPCR方法鑒定出12份為呼吸道合胞病毒經(jīng)過(guò)AGELISA鑒定出8份呼吸道合胞病毒通過(guò)針對(duì)黏附蛋白G蛋白基因的引物的RTPCR反應(yīng)共有6份標(biāo)本擴(kuò)增出了陽(yáng)性條帶對(duì)這6份病毒標(biāo)本的RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定獲得這些病毒的G蛋白基因全長(zhǎng)核苷酸序列分別編號(hào)為HENAN2006A36、HENAN2006A39、HENAN2006207、HENAN2006305、HENAN2006417、HENAN2006589其核苷酸序列長(zhǎng)度均為922BP。將所得到的核苷酸序列導(dǎo)入DNASTAR軟件MEGALIGN模塊中進(jìn)行核苷酸序列同源性分析通過(guò)分離毒株序列兩兩比較其同源性最大99％最小88％將所測(cè)核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列進(jìn)行同源性比較同源性在90％95％之間其與RSVA型毒株序列同源性為87％94％與RSVB型毒株序列同源性33％35％。從PUBMED基因數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并下載多條RSV毒株G蛋白基因核苷酸參考序列與樣本序列導(dǎo)入DNASTAR軟件MEGALIGN模塊中進(jìn)行比較并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)確定病毒型別。通過(guò)比較不同的RSV鑒定方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明共檢測(cè)12株呼吸道合胞病毒其中組織培養(yǎng)分離出5株病毒REALTIMEPCR檢出12株病毒AGELISA檢出8株病毒對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理檢出率經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)REALTIMEPCR和AGELISA兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P010Χ2225檢測(cè)敏感性沒(méi)有顯著性差異都可以用來(lái)進(jìn)行快速檢測(cè)。結(jié)論1通過(guò)檢測(cè)結(jié)果的比較REALTIMEPCR實(shí)驗(yàn)與AGELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)于呼吸道合胞病毒的檢測(cè)檢測(cè)敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2在我省部分地區(qū)20062007年度嬰幼兒急性呼吸道感染病例中RSV感染毒株以A型毒株為主。

簡(jiǎn)介：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）博士學(xué)位論文細(xì)支氣管肺泡癌的分子生物學(xué)研究姓名繆若羽申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師李龍蕓20080601中文摘要研究背景細(xì)支氣管肺泡癌BAC是肺腺痛中的一個(gè)亞型，具有單純細(xì)支氣管肺泡生長(zhǎng)模式，而沒(méi)有基質(zhì)、血管或胸膜侵犯的證據(jù)。據(jù)報(bào)道，腺癌伴BAC特征和BAC局灶浸潤(rùn)性腺癌與單純BAC的預(yù)后的相類似，均明顯好于其他腺癌患者。近年來(lái)一些發(fā)達(dá)國(guó)家的研究資料提示，BAC的發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)。靶向治療是近年腫瘤學(xué)界韻研究熱點(diǎn)之一，大型研究顯示，對(duì)EGFRTKI敏感的患者傾向于為腺癌或BAC，這使得對(duì)該NSCLC亞型，特別是其與EGFR之問(wèn)關(guān)系的研究興趣有了相當(dāng)程度的提高。人乳頭瘤病毒HPV是一類嗜上皮的DNA致瘤病毒。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷有從肺癌組織中檢出HPVDNA相關(guān)序列的文獻(xiàn)報(bào)道。但HPV感染與肺癌發(fā)牛的關(guān)系，目前說(shuō)法不一。目的探索BAC分子生物學(xué)特點(diǎn)，包括EGFRTK結(jié)構(gòu)域的突變、EGFR和HER2的基因拷貝數(shù)和蛋白表達(dá)，探討它們與BAC的發(fā)生發(fā)展、治療反應(yīng)以及預(yù)后的關(guān)系，并探討HPV感染在BAC發(fā)生中的作用。方法采用PCR和DNA測(cè)序法檢測(cè)中國(guó)人BAC右蠟包埋組織標(biāo)本EGFR基兇突變情況，PCR和EGFR突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)BAC患者外周咖EGFR基因突變情況，熒光原位雜交法FISH檢測(cè)組織標(biāo)奉中癌細(xì)胞的EGFR和HER2基因拷貝數(shù)，免疫組織化學(xué)法IHC檢測(cè)EGFR和HER2的蛋白表達(dá)，PCR和DNA原位雜交法ISH檢測(cè)HPVDNA，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSSL40軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果BAC組織標(biāo)本中EGFR基因突變牢50％16／32，其中7例占438％為外顯子19上的缺失突變，L例62％為D807N，850％為L(zhǎng)858R；EGFR基因突變與性別PO476、吸煙情況PO414、病理亞型P0151和EGFR蛋白表達(dá)PO231沒(méi)有顯著相關(guān)性，與EGFR基因拷貝數(shù)有非常顯著的相關(guān)性PO001。8例外周血EGFR檢測(cè)中5例625％檢測(cè)到EGFR基因突變，包4

簡(jiǎn)介：蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究小鼠急、慢性肝損傷姓名齊蕊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)生物物理學(xué)指導(dǎo)教師王勤20060501蘭卅L大學(xué)碩士研究生論文應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究小鼠急、慢性肝損傷摘要小鼠酒精性肝損傷分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的探討目前酒精性肝損傷的發(fā)病率呈逐年上漲趨勢(shì)，對(duì)酒精性肝病的診斷需要多種指標(biāo)相互驗(yàn)證。本文擬探討若干基因作為肝損傷分子生物學(xué)檢測(cè)候選指標(biāo)的可行性。首先取小鼠120只隨機(jī)分成正常組和肝損傷模型組，連續(xù)給與模型組小鼠灌喂酒精。于第6周、第12周檢測(cè)到模型組小鼠血清AUL活性有所升高，TP、ALB含量顯著下降，而GLB含量無(wú)明顯變化；肝組織病理切片顯示肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，有脂肪變性以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等特征。提示酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型成立。然后分別提取模型組和正常組小鼠肝組織RNA，經(jīng)SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成CDNA。在正常組和模型組CDNA中，用PCR擴(kuò)增CDL4、LBP、MCP．1、ICAM一1、IL．10、OPN6個(gè)基因片斷。結(jié)果顯示以上基因在模型組中的表達(dá)均顯著高于正常組；且隨損傷程度加深，LBP、MCP一1、1CAM．1、IL．10表達(dá)量亦呈增加趨勢(shì)。因此，這些基因可作為用分子生物學(xué)方法檢測(cè)酒精性肝損傷的候選指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)為在分子水平上進(jìn)行肝損傷的檢測(cè)提供理論依據(jù)。用SSH方法構(gòu)建CCH誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達(dá)基因的CDNA文庫(kù)本文利用抑制性消減雜交方法構(gòu)建了CCI。誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達(dá)基因的CDNA文庫(kù)。首先建立CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷的小鼠模型小鼠腹腔注射40％CCH花生油溶液4060，16H后檢測(cè)到血清中AST、』6止T活性均明顯升高，TP、ALB含量顯著下降，GLB含量無(wú)明顯變化；病理切片顯示肝細(xì)胞有氣球樣變性、小葉結(jié)構(gòu)模糊、血管充血、部分淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。提示CCI。誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型成立。然后我們?cè)谠撃Ｐ椭袑ふ遗c正常鼠肝組織差異表達(dá)的基因并構(gòu)建消減CDNA文庫(kù)1分別提取肝組織MRNA，用SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成CDNA，經(jīng)過(guò)酶切、接頭連接、兩輪消減雜交及兩輪抑制性PCR，使得差異表達(dá)的CDNA片段得以富集；2用T／A克隆構(gòu)建差異表達(dá)基因的CDNA消減文庫(kù)；3隨機(jī)挑選60個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，其中有55個(gè)克隆有200．750BP的插入片斷，證實(shí)建庫(kù)成功。該CDNA文庫(kù)的構(gòu)建為進(jìn)一步篩選出代表急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達(dá)的CDNA片段，并對(duì)這些CDNA進(jìn)行序列測(cè)定、序列同源性分析以及進(jìn)行完整基因的克隆、鑒定奠定了基礎(chǔ)；為基因藥物和診斷基因芯片的研發(fā)提供了依據(jù)。關(guān)鍵詞酒精性肝損傷、CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷、基因的差異表達(dá)、CDNA文庫(kù)、抑制性消減雜交SSH

簡(jiǎn)介：1F905鑫3菪分類號(hào)R7566單位代碼10159學(xué)號(hào)200340094中回鏨升大拳碩士學(xué)位論文具有研究生畢業(yè)同等學(xué)力申請(qǐng)學(xué)位人員題目應(yīng)用巢式PCR進(jìn)行申克孢子絲菌的分子生物學(xué)鑒定IDENTIFICATIONOFSPOROTHIXSCHENCKIIBYNESTEDPCRASSAY申請(qǐng)人徐天華推薦人簽堡塋論文課題起止時(shí)間2005年4月一2006年3月論文完成時(shí)間2006年5月應(yīng)用巢式PCR進(jìn)行申克孢子絲菌的分子生物學(xué)鑒定目的探討孢子絲菌病的分子生物學(xué)快速診斷方法。材料及方法一、實(shí)驗(yàn)材料1實(shí)驗(yàn)菌株臨床分離的申克孢子絲菌38株其中中國(guó)15株，日本1L株，美國(guó)4株，委內(nèi)瑞拉3株，阿根廷2株，澳大利亞、南非、法國(guó)各1株，MTDNA型1～24均包括其中?？巳崮钪榫?、白念珠菌、馬爾尼菲青霉、煙曲霉、疣狀瓶霉、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、新型隱球菌、須癬毛癬菌、卡氏枝孢霉菌種各L株，均為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所保存菌株。CEMTOCYSTISMINOR2株，均為日本TOKYO醫(yī)學(xué)真菌研究所保存菌株。2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10只BALB／C小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重22G～249，8～10W，購(gòu)自遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠被分為兩組，1組雄性5只，1組雌性5只。3臨床標(biāo)本9個(gè)經(jīng)真菌培養(yǎng)確診的人孢子絲菌病的病理活檢標(biāo)本來(lái)自于本科。二、實(shí)驗(yàn)試劑1基因組DNA提取主要試劑基因組DNA提取液CTABHEXADECYLTRIMETHYL刪ONIUMBROMIDE，十六烷基三甲基溴化銨。2PCR主要試劑21真菌特異性外層引物SS。和SS22真菌特異性內(nèi)層引物SS，和SS。3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)試劑31標(biāo)準(zhǔn)菌株A‘RCCL0268申克孢子絲菌菌懸液1一一叵匱～文一～中～一；，L

簡(jiǎn)介：背景和目的槲皮素是一種廣泛存在于自然界（如蔬菜、水果及其他日常飲食）中的具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用的黃酮類化合物。大量研究表明槲皮素可通過(guò)改變反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞基因的表達(dá)來(lái)保護(hù)神經(jīng)元和減少神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，探究槲皮素對(duì)劃痕愈合的影響及其作用機(jī)制，將為我們后續(xù)研究槲皮素和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷中的作用奠定基礎(chǔ)，也為膠質(zhì)疤痕的形成機(jī)理提供新的研究思路。膠質(zhì)成熟因子，是由142個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為17KDA的蛋白質(zhì)小分子，主要包括膠質(zhì)成熟因子ΒGMFB和膠質(zhì)成熟因子ΓGMFG。GMFB主要表達(dá)分布于脊椎動(dòng)物的大腦中，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中起了重要的調(diào)節(jié)作用。GMFG，膠質(zhì)成熟因子家族的一個(gè)新成員，其基因序列和氨基酸序列和GMFB具有高度的相似性（在大鼠中，其基因水平的相似度達(dá)71％氨基酸序列的相似度達(dá)789％），故將其命名為膠質(zhì)成熟因子Γ。GMFG的表達(dá)分布與GMFB的表達(dá)分布不同，GMFG高度表達(dá)分布在造血系統(tǒng)（包括粒細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血?。?、胸腺、脾臟、胚胎的肝臟及肺臟中，GMFG的進(jìn)化與有分化和增殖潛能的造血免疫系統(tǒng)的進(jìn)化同步。GMFG在神經(jīng)和大腦中的表達(dá)分布并不比其他組織中高，大鼠大腦中GMFG的MRNA可在大腦海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞中檢測(cè)到5。GMFG在大鼠（鼠齡為E14P1）的視網(wǎng)膜的內(nèi)限膜中也可被探測(cè)到，對(duì)其膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化可能起了重要作用。但是到目前為止，GMFG在大腦中詳細(xì)的表達(dá)分布狀況及其功能仍然未知。近年來(lái)更多的研究聚焦于槲皮素的抗腫瘤作用，研究表明槲皮素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡如白血病細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞等?？谇击[狀上皮癌，是世界上第六種最常見(jiàn)的惡性腫瘤外科手術(shù)和放療化療是治療口腔鱗狀上皮癌的最佳選擇方案，但口腔上皮癌細(xì)胞的多重耐藥性是其化療根治和化療失敗的一大難題。PGLYCOPROTEINPGP是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多重耐藥的主要機(jī)制之一，大量研究顯示槲皮素能抑制PGP的表達(dá)，降低多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性，如人胰腺癌細(xì)胞和CACO2細(xì)胞而是否槲皮素可以抑制口腔鱗狀上皮癌的生長(zhǎng)，并通過(guò)降低PGP的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)其多重耐藥性目前尚不清楚。本研究分為以下三個(gè)部分第一部分、槲皮素抑制膠質(zhì)疤痕愈合的分子生物學(xué)機(jī)制的探究一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕Ⅲw外星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移模型，探究槲皮素對(duì)劃痕愈合及其對(duì)膠質(zhì)疤痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探究其可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為膠質(zhì)疤痕的治療尋找一種潛在的藥物。二、實(shí)驗(yàn)方法1星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光染色后進(jìn)行純度鑒定，陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)95％以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。2體外星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移模型的建立及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)分為三組，第一組為對(duì)照組C組，僅作劃痕處理第二組為劃痕加DMSO處理組（D組），第三組為劃痕加槲皮素處理組（Q組）劃痕操作如下，于35MM培養(yǎng)皿的蓋上劃出縱橫交錯(cuò)的九道格，將蓋置于膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)皿下面，用10ΜL加樣器槍頭沿蓋上的格橫豎各劃九道，換液除去脫落細(xì)胞，然后置于5％的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每組三個(gè)培養(yǎng)皿。在低倍鏡下拍照，并通過(guò)NISELEMENTSD軟件測(cè)量劃痕的寬度，以此作為該視野劃痕的寬度計(jì)算其遷移指數(shù)。遷移指數(shù)的計(jì)算公式為IX3LXLCLDLQ。3WESTERNBLOT通過(guò)WESTERNBLOT分析槲皮素對(duì)CASPASE3、ERK12及PERK12蛋白表達(dá)的影響然后通過(guò)GELPROANALYZERALPHAINNOTECHCP，CA分析軟件，對(duì)蛋白的表達(dá)狀況進(jìn)行定量分析（目的蛋白內(nèi)參蛋白）。4LIVEDEAD染色培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞用PBS洗三遍以后，取200ΜLLIVEDEAD混合標(biāo)記液加入到各組培養(yǎng)皿中進(jìn)行避光染色15MIN后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察活細(xì)胞（呈綠色）和損傷細(xì)胞（呈紅色）的情況。5CLICKITEDUTEST培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞半量換液，加入1ML含20ΜMOLLEDU的全培養(yǎng)液。將其置于37℃，5％的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24H后棄去培養(yǎng)液，加入1ML37％甲醛室溫下固定15MIN，用3％BSA洗兩遍。然后再加入1ML05％TRITONX100室溫下孵育20MIN用3％BSA洗兩遍。然后加入05MLCLICKIT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30MIN。用3％BSA洗一遍然后再加入1ML1HOECHST33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30MIN。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計(jì)算其增殖細(xì)胞百分比，以上實(shí)驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)3次。6細(xì)胞周期分析將處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞用025％胰酶37℃消化5MIN，收集的懸浮細(xì)胞室溫下1500RMIN離心5MIN。棄上清，加入250ΜL胰酶溶液（A液），混勻后，室溫下反應(yīng)10MIN。然后再加入200ΜL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），混勻后，室溫下反應(yīng)10MIN。最后加入200ΜL冰冷的PI染液C液，混勻后，4℃避光反應(yīng)10MIN然后將其在3H內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1槲皮素對(duì)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕愈合的影響與對(duì)照組相比，槲皮素50ΜMOLL能明顯抑制劃痕的愈合，在6H時(shí)就有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而DMSO對(duì)劃痕的愈合無(wú)影響在第72H時(shí)C組和D組的部分視野已開(kāi)始愈合。2槲皮素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞生存的影響LIVEDEAD染色后鏡下觀察C組、D組和Q組的細(xì)胞均為綠色活細(xì)胞，生長(zhǎng)狀況良好。這說(shuō)明該濃度槲皮素（50ΜMOLL）對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，對(duì)其死亡無(wú)影響。3槲皮素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響免疫熒光染色和WESTERNBLOT檢測(cè)顯示槲皮素（50ΜMOLL）對(duì)凋亡蛋白酶的表達(dá)無(wú)影響，以上研究表明槲皮素（50ΜMOLL）對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡無(wú)影響。4槲皮素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組相比，槲皮素能明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖比例是槲皮素處理組的10倍以上。槲皮素處理24H后，G1期星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例由8204％增加到9206％，而S期和G2期的比例相應(yīng)降低。以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA的合成來(lái)抑制其增殖。5槲皮素可通過(guò)降低ERK12的磷酸化水平來(lái)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移與對(duì)照組相比，第24H時(shí)槲皮素50ΜMOLL能使ERK12的磷酸化水平降低大約45％，此外，槲皮素對(duì)ERK12磷酸化水平的影響有一定的時(shí)間和濃度依賴性。隨時(shí)間的變化，ERK12的磷酸化水平逐漸降低，第12H時(shí)ERK12的磷酸化水平降到了最低，此后開(kāi)始回升。在0100ΜMOLL的濃度范圍內(nèi)，隨著槲皮素的濃度增加，ERK12的磷酸化水平逐漸降低。U0126可明顯降低ERK12的磷酸化水平，并且可明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞體外劃痕的愈合。用磷酸酶抑制劑，釩酸鹽，維持槲皮素處理過(guò)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的ERK12的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)釩酸鹽可逆轉(zhuǎn)槲皮素抑制劃痕愈合的效應(yīng)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的槲皮素（50ΜMOLL）對(duì)膠質(zhì)劃痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存和凋亡無(wú)影響，槲皮素可通過(guò)抑制膠質(zhì)劃痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移來(lái)抑制劃痕的愈合。第二部分、膠質(zhì)成熟因子在大鼠大腦中的表達(dá)狀況分析及其功能的初步探究一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆治鯣MFG蛋白在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)狀況，比較GMFB和GMFG在大腦組織和細(xì)胞中的表達(dá)和分布狀況，探究GMFG在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的功能。二、實(shí)驗(yàn)方法1細(xì)胞培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、大鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)、大鼠膠質(zhì)瘤9L和C6細(xì)胞系的培養(yǎng)。2人膠質(zhì)瘤及其正常大腦組織樣品所有人膠質(zhì)瘤及其正常大腦組織樣品（共22例）均取自于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科。3免疫熒光染色用細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)GMFB和GMFG在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元上的表達(dá)情況。4WESTERNBLOT通過(guò)WESTERNBLOT檢測(cè)GMFB和GMFG在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及大腦組織中表達(dá)狀況。5免疫組化通過(guò)免疫組化染色探究GMFB和GMFG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)分布狀況。6REALTIMEPCR通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)GMFB和GMFG在不同細(xì)胞系或不同組織中基因水平上的變化7免疫共沉淀通過(guò)免疫共沉淀探究并分析星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和GMFBGMFG相互作用。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1GMFB和GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)狀況分析本研究從基因、蛋白及細(xì)胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)及存在，免疫熒光染色顯示GMFB主要表達(dá)分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中，幾乎所有細(xì)胞均表達(dá)GMFB而GMFG表達(dá)分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，GMFG在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)以細(xì)胞核為中心向細(xì)胞質(zhì)的四周放射。2GMFB和GMFG在大鼠大腦中的區(qū)域依賴性分布免疫組化結(jié)果表明，GMFB在大腦中分布廣泛，尤其是在海馬的錐體細(xì)胞中表達(dá)最為明顯。相比之下，GMFG并不是在整個(gè)大腦中都可探測(cè)到，僅可在部分細(xì)胞中探測(cè)到，GMFG在海馬的錐體細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)，其次是大腦髓質(zhì)層和大腦的基底核，在大腦皮質(zhì)的表達(dá)最弱。3GMFB和GMFG在大鼠大腦中的年齡依賴性表達(dá)GMFB的MRNA表達(dá)水平明顯高于GMFG，GMFB的MRNA表達(dá)水平從出生后的第7天開(kāi)始明顯下降，出生后的第8個(gè)月達(dá)到最低而GMFG的MRNA表達(dá)水平在出生后的第7天達(dá)到了最高峰，此后開(kāi)始下降，出生后的第8個(gè)月達(dá)到最低。在出生后的第7天GMFB蛋白的表達(dá)量達(dá)到了高峰，隨后開(kāi)始降低，1個(gè)月后趨于穩(wěn)定而GMFG蛋白的表達(dá)量在出生后一直降低。4GMFB在星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的表狀況分析結(jié)果顯示GMFB在大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞核上的表達(dá)增強(qiáng)，在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)無(wú)明顯變化。前面的研究已證實(shí)隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，GMFB在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)逐漸減弱。膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為一種未成熟和未分化的膠質(zhì)細(xì)胞在其細(xì)胞核上呈現(xiàn)出高表達(dá)。因此推測(cè)可能存在一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和GMFB的表達(dá)之間存在重要的調(diào)節(jié)作用。正因?yàn)檫@種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致了GMFB在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系9L和C6細(xì)胞核上的高表達(dá)。5GMFG在星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞上表狀況分析結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GMFG無(wú)論是在MRNA水平上還是蛋白水平上的表達(dá)狀況均明顯低于其在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)水平。除此之外，通過(guò)免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)GMFG在膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于其在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)強(qiáng)度。研究顯示GMFG和GFAP之間確實(shí)存在某種相互作用，而GMFB和GFAP之間無(wú)該種相互作用。6GMFG在人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本上的表達(dá)狀況分析免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4580％的正常腦組織標(biāo)本呈陽(yáng)性，475714％Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本呈陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的陽(yáng)性率顯著低于正常腦組織標(biāo)本X265，P＜005，費(fèi)舍爾確切概率法在陽(yáng)性標(biāo)本中，不管細(xì)胞類型如何，GMFG在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均呈現(xiàn)陽(yáng)性。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，與正常大腦組織標(biāo)本相比，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的表達(dá)水平明顯下降。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究從基因、蛋白及細(xì)胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存在，比較了GMFB和GMFG在大鼠大腦中的組織分布狀況，發(fā)現(xiàn)其在大鼠大腦中的分布具有區(qū)域依賴性，其表達(dá)具有時(shí)間依賴性此外，本研究發(fā)現(xiàn)GMFB和GMFG在正常的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系之間表達(dá)狀況的差異，并進(jìn)一步證實(shí)了其在人正常的腦組織和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本上的表達(dá)狀況之間的差異。本研究第一次提出了GMFB在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)狀況的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，并對(duì)GMFG在膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用做了初步探究。第三部分、槲皮素對(duì)KBV細(xì)胞及其耐藥機(jī)制的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶骄块纹に貙?duì)耐長(zhǎng)春新堿的口腔鱗狀上皮癌KBV細(xì)胞系侵襲、遷移、增殖及其凋亡的影響，進(jìn)一步分析槲皮素降低耐藥相關(guān)蛋白PGP表達(dá)后KBV細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。二、實(shí)驗(yàn)方法1細(xì)胞培養(yǎng)人KBV細(xì)胞細(xì)胞系采用含10％的胎牛血清、200NMOLLVCR的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2TRANSWELL體外遷移實(shí)驗(yàn)將饑餓1224H后的KBV細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗12遍，用含01％FBS的1640配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5X104。取200ΜL細(xì)胞懸液加入TRANSWELL上室，含10％FBS的1640培養(yǎng)基500ΜL加入下室。37℃5％的CO2培養(yǎng)12H后，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定10分鐘，01％結(jié)晶紫室溫孵育10MIN，清水漂洗3遍以上。TRANSWELL小室翻過(guò)來(lái)底面朝上置顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。3TRANSWELL體外侵襲實(shí)驗(yàn)將用1640做1∶5稀釋后的MATRIGEL涂于細(xì)胞生長(zhǎng)面，150200ΜLCM2，37℃作用30分鐘，備用。將饑餓1224H后的KBV細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗12遍，用含01％FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5X104個(gè)CM2。取200ΜL細(xì)胞懸液加入TRANSWELL上室，取含10％FBS的1640培養(yǎng)基500ΜL加入下室。37℃，5％的CO2培養(yǎng)36H后，用棉簽擦去MATRIGEL和上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定10分鐘01％結(jié)晶紫室溫染色10分鐘，清水漂洗3遍以上。TRANSWELL小室翻過(guò)來(lái)底面朝上置顯微鏡下觀察拍照計(jì)數(shù)。4ΜTT測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)取5103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基移去，分別加入200ΜL含濃度為0、25、50、75和100ΜMOLL槲皮素的10％FBSRPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)12H、24H和48H后，每孔中加入20ΜL5MGML的34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴鹽MTT繼續(xù)培養(yǎng)4H，然后用200ΜL加樣槍將液體小心地移去，每孔加入二甲基亞砜DMSO150ΜL，微振蕩器振蕩10MIN，用SPECTRAMAXM5多功能酶標(biāo)儀在490NM波長(zhǎng)下測(cè)光密度值。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)三次試驗(yàn)。5CLICKITEDU檢測(cè)將處理好的KBV半量換液，加入1ML含20ΜMOLLEDU的全培養(yǎng)液，其最終工作濃度為10ΜMOLL。將其置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24H后棄去培養(yǎng)液，加入1ML37％甲醛室溫下固定15MIN，棄去固定液，用3％BSA洗兩遍。然后再加入1ML05％TRITONX100室溫下孵育20MIN棄去通透液，用3％BSA洗兩遍。然后加入05MLCLICKIT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30MIN。棄去反應(yīng)液，用3％BSA洗一遍。然后再加入1ML1XHOECHST33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30MIN。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計(jì)算其增殖細(xì)胞百分比，以上實(shí)驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)3次。6細(xì)胞周期分析將收集的懸浮細(xì)胞室溫下400G離心5MIN。棄上清，加入250ΜL胰酶溶液（A液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10MIN。然后再加入200ΜL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10MIN。最后加入200ΜL冰冷的PI染液（C液）用手指輕彈將其混勻，4℃避光反應(yīng)10MIN。然后將其在3H內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以上實(shí)驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)3次。7細(xì)胞凋亡分析將消化的KBV細(xì)胞用PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集1106個(gè)細(xì)胞，加入500ΜL的BINDINGBUFFER重懸細(xì)胞。加入5ΜL的ANNEXINVFITC混勻后再加入5ΜL的PROPIDIUMIODIDE，混勻室溫避光反應(yīng)515MIN。在染色后1H內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，以上實(shí)驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)三次。8WESTERNBLOTWESTERNBLOT分析槲皮素對(duì)CASPASE3、BAX、BCL2及PGP蛋白表達(dá)的影響，然后通過(guò)GELPROANALYZERALPHAINNOTECHCPCA分析軟件，對(duì)蛋白的表達(dá)狀況進(jìn)行定量分析（目的蛋白內(nèi)參蛋白）。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1MTT檢測(cè)槲皮素對(duì)KBV細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響低濃度25ΜMOLL的槲皮素處理12H、24H和48H后，KBV細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為（1376±2679）％，（1463±4262）％和（1680±3876）％統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該濃度槲皮素的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)并未隨著時(shí)間增長(zhǎng)而升高。槲皮素對(duì)KBV細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)隨著槲皮素濃度的上升而增高，第48H時(shí)，75ΜMOLL槲皮素的生長(zhǎng)抑制率為50％，因此其IC50值為75ΜMOLL。2槲皮素可抑制KBV細(xì)胞遷移和侵襲能力與對(duì)照組相比，處理組遷移侵襲比例顯著降低，25ΜMOLL，50ΜMOLL和100ΜMOLL槲皮素處理組其遷移細(xì)胞百分比分別為6014％，3040％和1393％P＜001侵襲細(xì)胞百分比分別為3857％、2227％和512％P＜001。3槲皮素對(duì)KBV細(xì)胞增殖及其細(xì)胞周期的影響50ΜMOLL槲皮素處理24H后，對(duì)照組增殖細(xì)胞百分比為槲皮素處理組的兩倍。50ΜMOLL槲皮素處理24H后，G1期細(xì)胞的比例明顯升高，由4241％升高到5266％P＜001，S期細(xì)胞的比例明顯降低，由5224％降低到4304％P＜001。4槲皮素對(duì)KBV細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比，槲皮素處理組其凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，且有一定的濃度依賴性，槲皮素濃度為100ΜMOLL時(shí)其凋亡細(xì)胞百分比為1753％。5槲皮素對(duì)BCL2、BAX及CASPASE3蛋白表達(dá)的影響槲皮素處理24H后，隨著槲皮素濃度的升高，抗凋亡蛋白BCL2和35KDA的CASPASE3蛋白表達(dá)量逐漸降低，而抑凋亡相關(guān)蛋白BAX和17KDA的CLEAVEDCASPASE3蛋白表達(dá)量逐漸升高，均有一定的濃度依賴性，以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過(guò)線粒體途徑來(lái)誘導(dǎo)KBV細(xì)胞的凋亡。6槲皮素對(duì)耐藥相關(guān)蛋白PGLYCOPROTEIN表達(dá)的影響用0、25、50、75及100ΜMOLL槲皮素處理KBV細(xì)胞24H后，WESTERNBLOT檢測(cè)顯示PGP的表達(dá)量發(fā)生明顯改變，隨著槲皮素濃度的升高，PGP的表達(dá)量逐漸降低，有一定的濃度依賴性。與對(duì)照組相比，25、50、75及100ΜMOLL槲皮素處理KBV細(xì)胞24H后，PGP的表達(dá)量分別為91％、83％、66％和45％。7槲皮素可通過(guò)下調(diào)PGP表達(dá)來(lái)增強(qiáng)KBV細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性與對(duì)照組和長(zhǎng)春新堿單獨(dú)處理組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低PGP的表達(dá)量，而與槲皮素處理組相比卻無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與單獨(dú)用藥組和對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低其增殖細(xì)胞百分比，并且其凋亡比例也顯著升高。與對(duì)照組和單獨(dú)處理組相比，聯(lián)合用藥組KBV細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞比率降至882％和127％以上研究進(jìn)一步證明槲皮素可通過(guò)下調(diào)PGP的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)KBV細(xì)胞對(duì)化療藥物長(zhǎng)春新堿的敏感性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制KBV細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖以及與其凋亡和耐藥相關(guān)的分子信號(hào)機(jī)制，且可增強(qiáng)其對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。

簡(jiǎn)介：鉤蟲(chóng)感染仍為當(dāng)今人體重要的腸道寄生蟲(chóng)感染之一嚴(yán)重危害人們尤其農(nóng)民和礦工的身體健康。作者從2005年3月至2009年1月完成了以下幾個(gè)部分調(diào)查和研究以期闡明閩南城鄉(xiāng)和礦區(qū)人體鉤蟲(chóng)病的流行病學(xué)特征并對(duì)鉤蟲(chóng)的生物學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)行研究為設(shè)計(jì)防治措施提供科學(xué)依據(jù)。獲得了以下主要研究結(jié)果1閩南城鄉(xiāng)人體腸道寄生蟲(chóng)調(diào)查在廈門(mén)、漳州、龍巖和南平等4市調(diào)查13個(gè)點(diǎn)共檢查了13314人檢出鉤蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)和蟯蟲(chóng)等腸道寄生蟲(chóng)總感染率1031％感染人數(shù)分別為1070、98、33和172感染率依次為804％、074％、025％、129％構(gòu)成比分別為7791％717％242％1250％。其中發(fā)現(xiàn)廈門(mén)市同安區(qū)蓮花鎮(zhèn)美埔村鉤蟲(chóng)感染率為4000％40100為鉤蟲(chóng)重度流行區(qū)。證明在閩南城鄉(xiāng)人體鉤蟲(chóng)感染仍較嚴(yán)重。2閩南城鄉(xiāng)及礦區(qū)人體鉤蟲(chóng)流行病學(xué)特征1散發(fā)性特征調(diào)查發(fā)現(xiàn)重度和中度感染鉤蟲(chóng)的病例多以散發(fā)的形式發(fā)生歸為兩類第一類為外來(lái)務(wù)工人員集中區(qū)如礦工和居住在城鄉(xiāng)接合部等種植蔬菜、水果的外來(lái)民工；第二類是少部分本地50歲以上的中、老年人。2和性別、年齡關(guān)系男、女鉤蟲(chóng)感染差異顯著X24189P＜005。同時(shí)鉤蟲(chóng)感染率有隨年齡的增長(zhǎng)而升高趨勢(shì)感染年齡最小的8個(gè)月最大的89歲均為女性。各年齡組鉤蟲(chóng)感染率差異顯著X275890P＜005。年齡與感染率之間的統(tǒng)計(jì)分析呈正相關(guān)年齡與感染率兩變量間高度相關(guān)回歸系數(shù)經(jīng)顯著檢驗(yàn)有差異顯著R09800P＜005。50歲以上人群中中度和重度感染的比例較大分別為8816％8410％。由此可見(jiàn)鉤蟲(chóng)對(duì)50歲以上中、老年人身體危害較大應(yīng)予特別關(guān)注。3蟲(chóng)種特征261份鉤蟲(chóng)蟲(chóng)卵陽(yáng)性糞便培養(yǎng)結(jié)果表明閩南城鄉(xiāng)系以美洲鉤蟲(chóng)為主的2種人體鉤蟲(chóng)即美洲鉤蟲(chóng)和十二指腸鉤蟲(chóng)混合感染流行區(qū)美洲鉤蟲(chóng)感染占絕大多數(shù)；而來(lái)閩務(wù)工的外省籍人口包括江西四川、湖北、浙江、安徽等以十二指腸鉤蟲(chóng)為主稍高于美洲鉤蟲(chóng)。4和職業(yè)關(guān)系以從事種植蔬菜、水果草莓、龍眼、園林綠化、垃圾填埋職業(yè)的來(lái)廈民工鉤蟲(chóng)感染率最高達(dá)到3399％。文化程度以初中感染率為最高6歲以下及大專以上最低文化程度的差異顯著X210702P＜005。A漳平煤礦礦工鉤蟲(chóng)重度感染占感染者總數(shù)8333％邵武煤礦礦工鉤蟲(chóng)中度、重度感染分別占感染者總數(shù)2500％833％表明鉤蟲(chóng)病至今仍然是礦區(qū)流行最廣的、危害最嚴(yán)重的腸道寄生蟲(chóng)病。礦區(qū)土壤污染以煤土、菜地鉤蚴居多。東孚垃圾場(chǎng)填埋工人以蛔蟲(chóng)輕度感染為主在城市從事種植的民工以鉤蟲(chóng)輕度和重度感染為主。居住時(shí)間不到1年者感染率較高2441％。B對(duì)島外某駐軍102名官兵及其家屬糞檢結(jié)果表明鉤蟲(chóng)為主要的腸道寄生蟲(chóng)感染占感染者總數(shù)7143％。5個(gè)廈門(mén)市常年污水監(jiān)測(cè)點(diǎn)發(fā)現(xiàn)攜帶寄生蟲(chóng)卵多的污水分布在同安和中山醫(yī)院的污水出口處且以鉤蟲(chóng)卵較多。高峰期在7月至8月可能與當(dāng)?shù)刂饕r(nóng)作物種植季節(jié)有相關(guān)性。5和民族關(guān)系在漳州市華安縣調(diào)查漢、畬2個(gè)民族表明畬族的感染率高于漢族2個(gè)民族人群鉤蟲(chóng)感染率差異顯著X2504P＜005。6家庭聚集性特征對(duì)369戶二項(xiàng)分布齊性檢驗(yàn)的G統(tǒng)計(jì)量顯示鉤蟲(chóng)感染家庭聚集性分布差異顯著P＜001建議防治注重以家庭為主體的服藥。訪問(wèn)415個(gè)居民寄防知識(shí)平均知曉率較低2915％。調(diào)查蔬菜被污染人體寄生蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)陽(yáng)性率為1429％菜地鉤蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)和鞭蟲(chóng)總感染率2857％以農(nóng)村較高。3廈門(mén)市兒童蟯蟲(chóng)感染現(xiàn)狀抽查7所幼兒園共625名兒童感染率為2320％6歲組最低5歲組最高各年齡組相差1周歲之間無(wú)顯著差異。男孩與女孩感染率分別為2821％和1821％差異顯著。外來(lái)民工子女蟯蟲(chóng)感染率遠(yuǎn)高于本地生源；環(huán)境蟯蟲(chóng)卵以兒童內(nèi)褲污染率較高857％670。此外還報(bào)道了蛔蟲(chóng)和鞭蟲(chóng)感染率隨年齡增長(zhǎng)的趨勢(shì)10～15歲年齡組達(dá)到頂峰分別為243％、093％。調(diào)查了70份狗、貓糞便中的犬鉤蟲(chóng)其感染率分別為2800％1450500％120前者感染率較高兩者差異顯著X2596P＜005。同時(shí)對(duì)若干重要人體寄生蟲(chóng)病例做了個(gè)案記述、感染史推測(cè)與分析。4根據(jù)形態(tài)學(xué)研究描述了圓線蟲(chóng)目STRONGYLIDA的四種線蟲(chóng)即美洲鉤蟲(chóng)、十二指腸鉤蟲(chóng)、犬鉤蟲(chóng)和東方毛圓線蟲(chóng)及桿形線蟲(chóng)目RHABDITIDA糞類圓線蟲(chóng)的形態(tài)特征。此外就蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵也做了形態(tài)描述。5自行設(shè)計(jì)了配套使用的一大一小的培養(yǎng)皿成功收集到大量鉤蚴其在相同的培養(yǎng)條件下獲得的幼蟲(chóng)數(shù)量相當(dāng)于“T”試管濾紙培養(yǎng)法的30～40倍并且所獲的蟲(chóng)體清潔不受糞便污染有利于鉤蟲(chóng)的生物學(xué)研究。6首次應(yīng)用線蟲(chóng)霧化分離器在分離土壤中的鉤蚴技術(shù)方面進(jìn)行了探討證明其分離效率隨著時(shí)間的推移而逐步提高且始終保持較高的成活率60％可用于土源性寄生蟲(chóng)流行病學(xué)大規(guī)模調(diào)查和實(shí)驗(yàn)寄生蟲(chóng)學(xué)研究。7用第5點(diǎn)方法獲得大量鉤蚴首次在沙盤(pán)中進(jìn)行對(duì)鉤蚴的引誘移行試驗(yàn)。①在沙盤(pán)含水率1520％的范圍內(nèi)大腸桿菌對(duì)美洲L3鉤蚴的誘引效果比無(wú)菌水的好；同時(shí)隨著含水率的提高大腸桿菌誘引到的鉤蚴增加而含無(wú)菌水的海綿條中鉤蚴減少。②在溫度2037℃的范圍內(nèi)大腸桿菌對(duì)鉤蚴的誘引效果比無(wú)菌水誘引的好；而隨著溫度的升高大腸桿菌和無(wú)菌水誘引到的鉤蚴出現(xiàn)不同程度的增加趨勢(shì)說(shuō)明溫度是影響鉤蚴移行的重要因子。③大腸桿菌、人體汗液皮屑比豬小腸內(nèi)容物、無(wú)菌水對(duì)鉤蚴具有較明顯的誘引作用。8在2％的水瓊脂平板上進(jìn)行大腸桿菌對(duì)鉤蚴的吸引試驗(yàn)美洲鉤蟲(chóng)、十二指腸鉤蟲(chóng)、犬鉤蟲(chóng)的鉤蚴都有向平板中心菌塊移動(dòng)的趨勢(shì)三者以美洲鉤蟲(chóng)L3鉤蚴吸引力占有明顯的優(yōu)勢(shì)。9分別克隆了十二指腸鉤蟲(chóng)的ITS158SITS2和18SRDNA序列上傳到GENEBANK中注冊(cè)登錄號(hào)分別為58SRRNA基因EU344796、ITS158SITS2EU344797、18SRRNA基因EU344798其中18SRDNA是新的序列。根據(jù)ITS1和ITS2的序列做了鉤口屬ANCYLOSTOMA的系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步從分子水平證實(shí)了與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致即供試鉤蟲(chóng)為十二指腸鉤蟲(chóng)ADUODENALE。利用18SRDNA序列對(duì)圓線目STRONGYLIDA進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明圓線目有3個(gè)主要進(jìn)化枝CLADE其中鉤口亞目ANCYLOSTOMATINA和圓線亞目STRONGYLINA共享同一個(gè)進(jìn)化枝自引支持度88％。RAPD分析結(jié)果表明十二指腸鉤蟲(chóng)ADUODENALE具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。

簡(jiǎn)介：肺結(jié)核是長(zhǎng)期嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病也是單因素所致感染性疾病中病死率最高的疾病之一。結(jié)核性胸膜炎作為肺外結(jié)核的類型之一約占肺結(jié)核患者的10％20％其中約10％30％的結(jié)核性胸膜炎患者臨床有胸腔積液表現(xiàn)。結(jié)核性胸腔積液作為常見(jiàn)的滲出性胸腔積液之一胸水TH1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起主導(dǎo)作用但近來(lái)研究結(jié)果表明除了TH1型免疫反應(yīng)TH2、TH9、TH17、TH22等免疫細(xì)胞亞群及協(xié)同刺激分子在結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展中亦具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激分子PDL1PROGRAMMEDDEATH1LIG1程序性死亡配體1又名B7H1在激活的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)增高并與機(jī)體的免疫抑制相關(guān)。業(yè)已證明肺結(jié)核患者外周血中PD1、PDL1表達(dá)顯著增高可能與結(jié)核病免疫耐受及慢性化炎癥相關(guān)。許多協(xié)同刺激分子如OX40、OX40LOX40配體、B7H3和CTLA4細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4等除膜型外還以可溶性的形式存在。既往對(duì)肺癌患者外周血可溶性PDL1SPDL1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清SPDL1表達(dá)異常增高并與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和療效相關(guān)。而胸腔積液中是否存在SPDL1及SPDL1在結(jié)核性胸腔積液中的生物學(xué)意義的研究并不多見(jiàn)。本研究中我們采用蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所自主研發(fā)的特異性人SPDL1的酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測(cè)體系對(duì)結(jié)核性胸腔積液患者開(kāi)展深入研究檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液中SPDL1的表達(dá)分析其臨床指導(dǎo)意義揭示SPDL1和PD1PDL1協(xié)同刺激信號(hào)與結(jié)核性胸腔積液疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系進(jìn)一步探究SPDL1在結(jié)核性胸腔積液中的生物學(xué)意義。為免疫學(xué)方法在結(jié)核性胸腔積液中的治療提供依據(jù)。一、可溶性PDL1在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血中的表達(dá)水平及臨床意義【目的】檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血中可溶性PDL1的表達(dá)水平并探討其臨床意義?！痉椒ā亢Y選2012年6月至2013年3月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科收治的初診胸腔積液患者68例其中結(jié)核性胸腔積液組共24例惡性胸腔積液組共30例非結(jié)核、非惡性胸腔積液組14例。收集上述人群胸腔積液和外周血清并記錄其臨床資料。采用酶聯(lián)免疫吸附方法ELISA檢測(cè)胸腔積液和外周血中SPDL1的水平。流式細(xì)胞法FCM檢測(cè)胸腔積液和外周血中CD4T細(xì)胞的表達(dá)、CD8T細(xì)胞的表達(dá)、PD1在CD4T細(xì)胞上的表達(dá)CD4PD1、PD1在CD8T細(xì)胞上的表達(dá)CD8PD1、CD14單核細(xì)胞和PDL1在CD14單核細(xì)胞上的表達(dá)CD14PDL1。反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)胸腔積液中PDL1、基質(zhì)金屬蛋白酶3MMP3基因表達(dá)。受試者工作特征ROC曲線分析SPDL1對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值?！窘Y(jié)果】結(jié)核性胸腔積液中SPDL1含量顯著高于惡性組和非結(jié)核、非惡性組P【結(jié)論】SPDL1反映了不同病因胸腔積液微環(huán)境中不同的免疫功能狀態(tài)結(jié)核性胸腔積液中SPDL1表達(dá)明顯增高可能與結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)胸水中SPDL1檢測(cè)有助于結(jié)核性胸腔積液的鑒別診斷。二、結(jié)核性胸腔積液中IFNΓ和IFNΑ的表達(dá)及PD1PDL1協(xié)同刺激信號(hào)在結(jié)核性胸膜炎中的免疫學(xué)作用【目的】檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液中IFNΓ和IFNΑ的表達(dá)水平并分析其臨床意義探討PD1PDL1協(xié)同刺激信號(hào)在結(jié)核性胸膜炎中的免疫學(xué)作用?！痉椒ā渴占鲜?8例胸腔積液患者胸腔積液標(biāo)本采用ELISA法檢測(cè)胸腔積液中IFNΓ和IFNΑ的表達(dá)水平。分離健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMCS以不同濃度結(jié)核性胸腔積液刺激培養(yǎng)后采用流式細(xì)胞術(shù)FCM檢測(cè)PBMCS細(xì)胞表面PDL1的表達(dá)變化CCK8摻入法檢測(cè)PBMCS增殖的改變。免疫磁珠法分選結(jié)核性胸腔積液中T淋巴細(xì)胞和CD14單核細(xì)胞CCK8摻入法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中T細(xì)胞增殖的改變?！窘Y(jié)果】結(jié)核性胸腔積液組中IFNΓ含量顯著高于惡性組和非結(jié)核、非惡性組P005。胸腔積液中SPDL1表達(dá)與TH1型主要細(xì)胞因子IFNΓ及胸腔積液腺苷脫氨酶ADA表達(dá)成正相關(guān)P00004P【結(jié)論】結(jié)核性胸腔積液中IFNΓ表達(dá)增高與胸腔積液中SPDL1表達(dá)成正相關(guān)聯(lián)合IFNΓ及各臨床指標(biāo)檢測(cè)有助于結(jié)核性胸腔積液的鑒別診斷高表達(dá)的TH1型細(xì)胞因子IFN?？赡芘cPD1PDL1協(xié)同刺激信號(hào)在結(jié)核性胸膜炎中的免疫作用相關(guān)。綜上所述本課題研究獲得了以下研究結(jié)果1結(jié)核性胸腔積液中SPDL1、TH1型細(xì)胞因子IFNΓ、CD8細(xì)胞表達(dá)和PDL1在CD14單核細(xì)胞表達(dá)增高SPDL1單因素檢測(cè)或聯(lián)合各臨床指標(biāo)有助于結(jié)核性胸腔積液的診斷。2結(jié)核性胸腔積液可體外促進(jìn)CD14單核細(xì)胞表面PDL1的表達(dá)及外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖增高表達(dá)的PDL1與T細(xì)胞表面PD1受體相結(jié)合抑制了機(jī)體的免疫效應(yīng)可能與結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。3通過(guò)抗PDL1單抗阻斷PD1PDL1途徑可部分恢復(fù)T淋巴細(xì)胞增殖能力為結(jié)核性胸腔積液的免疫治療提供了依據(jù)。

簡(jiǎn)介：目的利用人胚胎干細(xì)胞具有多向分化潛能的特性，使用小分子化合物特異性作用于調(diào)節(jié)表皮外胚層及角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中重要信號(hào)通路的某些調(diào)控位點(diǎn)，結(jié)合ΒFGF，誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化，以獲得角膜上皮樣細(xì)胞。方法懸滴法培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，獲得具有向三個(gè)胚層分化潛能的擬胚體EMBRYONICBODIES，EBS。將獲得的擬胚體于3D培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)，利用小分子化合結(jié)合ΒFGF，誘導(dǎo)擬胚體逐步向外胚層、表皮外胚層、角膜上皮樣細(xì)胞方向分化。懸浮培養(yǎng)4天后轉(zhuǎn)為貼壁培養(yǎng)，利用貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)條件及不同種類誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化。分別于誘導(dǎo)第10、20、30天取材，從基因水平、細(xì)胞水平檢測(cè)OCT4、P63、PAX6、K12、K14表達(dá)水平，判斷各組分化程度及分化效率。結(jié)果小分子化合物可下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平，上調(diào)角膜上皮樣細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)水平小分子化合物可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化小分子化合物結(jié)合不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基在不同誘導(dǎo)階段調(diào)控基因表達(dá)水平效率不同。結(jié)論小分子化合物聯(lián)合ΒFGF，通過(guò)特異性阻斷WNT、TGFΒ信號(hào)通路，可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化。在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)水平下調(diào)，角膜上皮細(xì)胞發(fā)育調(diào)控基因及角膜上皮細(xì)胞特征性標(biāo)記基因表達(dá)水平上調(diào)。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組（陰性對(duì)照組）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（陽(yáng)性對(duì)照組）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（陽(yáng)性對(duì)照組）相比，小分子化合物誘導(dǎo)上述基因表達(dá)上調(diào)時(shí)間出現(xiàn)早，且上調(diào)水平明顯高于其他三組。同時(shí)，小分子化合物結(jié)合不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基、在誘導(dǎo)分化不同階段的誘導(dǎo)分化效率存在差異。若為短期（1020天）誘導(dǎo)，小分子化合物SHEM、小分子化合物UM組誘導(dǎo)效率高若誘導(dǎo)周期長(zhǎng)30天以上，則以小分子化合物KSFM、小分子化合物DKSFM組誘導(dǎo)效率高。

簡(jiǎn)介：181工774河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師或指導(dǎo)小組的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)J、’，完成。本學(xué)位論文研究所獲的研究成果，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對(duì)本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開(kāi)和使用。兒發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué)，試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報(bào)的專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。研究生之名私榭舉P師簽章勞扣鬈』級(jí)學(xué)院毒‘。。。≯20FO年F月糾’日．河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫(xiě)，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名新椰體導(dǎo)師簽章肇矽釤導(dǎo)師簽章所∥Y2OFO年廠月2／日L目錄中文摘要?????????????????????????1英文摘要?????????????????????????3研究論文致病性地霉的分子生物學(xué)鑒定前言?????????????????????????66月U舌?????????????????????????材料與方法??????????????????????6結(jié)果?????????????????????????12附圖?????????????????????????14討論?????????????????????????19結(jié)論?????????????????????????24參考文獻(xiàn)???????????????????????25綜述念珠菌性陰道炎的研究進(jìn)展??????????????28致謝???????????????????????????44個(gè)人簡(jiǎn)歷?????????????????????????45