簡介：第一部分EGCG通過活化P38ΑMAPKBAX途徑誘導NB4細胞凋亡目的本實驗主要探討EGCG是否能夠誘導NB4細胞凋亡及其可能的分子機制。方法分別用不同濃度的EGCG處理NB4細胞，或預先用P38ΑMAPK的抑制劑PD169316處理NB4細胞半小時，再用相應(yīng)濃度的EGCG處理NB4細胞。用CCK8方法測定NB4細胞增殖狀況，用FITCANNEXINVPI雙染色法測定NB4細胞凋亡狀況，用WESTERNBLOT檢測P38ΑMAPK、PP38ΑMAPK、BCL2和BAX蛋白質(zhì)的表達水平。結(jié)果隨著EGCG濃度的增加，CCK8結(jié)果顯示EGCG依賴濃度梯度抑制NB4細胞增殖；流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)EGCG能夠明顯促進NB4細胞凋亡；同時WESTERNBLOT檢測發(fā)現(xiàn)PP38ΑMAPK和BAX蛋白質(zhì)表達水平升高，與EGCG濃度呈正相關(guān)，然而BCL2蛋白質(zhì)表達水平隨EGCG濃度升高而降低。在用P38ΑMAPK抑制劑處理后，CCK8結(jié)果表明EGCG抑制細胞增殖的能力明顯減弱，同時流式細胞術(shù)顯示EGCG促進細胞凋亡的能力也減弱；WESTERNBLOT結(jié)果顯示BAX蛋白質(zhì)表達程度降低，但BCL2蛋白質(zhì)表達程度無明顯變化。結(jié)論EGCG可能通過活化P38ΑMAPKBAX途徑誘導NB4細胞凋亡。第二部分EGCG通過SHP1調(diào)節(jié)的P38ΑMAPKBAX途徑誘導NB4細胞凋亡目的本實驗主要觀察EGCG是否通過SHP1調(diào)節(jié)的P38ΑMAPKBAX途徑誘導NB4細胞凋亡。方法分別用不同濃度的EGCG處理NB4細胞，或預先用SHP1的抑制劑NSC87877處理NB4細胞半小時，再用相應(yīng)濃度的EGCG處理NB4細胞。用CCK8方法測定NB4細胞增殖狀況，用FITCANNEXINVPI雙染色法檢測NB4細胞凋亡狀況，用WESTERNBLOT檢測SHP1、P38ΑMAPK、PP38ΑMAPK和BAX蛋白質(zhì)的表達水平。結(jié)果WESTERNBLOT檢測結(jié)果顯示EGCG能夠促進SHP1蛋白質(zhì)表達。預先用SHP1抑制劑NSC87877處理后，SHP1蛋白質(zhì)的表達水平明顯降低；同時CCK8結(jié)果顯示EGCG抑制細胞增殖的能力減弱，流式細胞術(shù)結(jié)果表明EGCG促進細胞凋亡的能力也減弱，WESTERNBLOT檢測結(jié)果顯示PP38ΑMAPK和BAX蛋白質(zhì)表達水平隨之減少，但P38ΑMAPK蛋白質(zhì)表達水平無明顯變化。結(jié)論EGCG通過SHP1調(diào)節(jié)的P38ΑMAPKBAX途徑誘導NB4細胞凋亡。

簡介：點擊查看更多不同凍存方法對軟骨細胞生物學特性的影響.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的體外分離培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細胞PMSCS并觀察其生物學特性；比較不同氧濃度對PMSCS向類髓核細胞誘導分化的生物學影響。方法第一部分人胎盤間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定采用酶消化加貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人PMSCS，流式細胞儀器FCM鑒定PMSCS表面標志，經(jīng)成骨、成脂肪誘導鑒定其分化能力。第二部分低氧對人胎盤間充質(zhì)干細胞向類髓核細胞誘導分化的生物學作用在不同氧濃度下5％，21％，用含有轉(zhuǎn)化生長因子Β1TGFΒ1的培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)PMSCS，CCK8法比較1D，3D，5D，7D不同氧濃度下分化細胞的增殖情況；3D，7D時實時熒光PCR法檢測HIF1Α，SOX9，COLLAGENⅡ和AGGRECAN基因的相對表達，比較不同氧濃度對PMSCS向類髓核細胞定向分化的影響；誘導培養(yǎng)2周后，行免疫熒光檢測Ⅱ型膠原在分化細胞中的表達。結(jié)果①PMSCS體外分離培養(yǎng)，其增殖迅速，短時間內(nèi)可大量擴增達到組織工程需要的種子細胞數(shù)量要求；FCM檢測PMSCS的表面抗原CD73、CD29、CD44、CD105均有不同程度表達，CD34、CD45和HLADR低表達或不表達，且細胞保持未分化狀態(tài)；經(jīng)誘導后可向成骨和成脂細胞方向分化。②通過CCK8法對細胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)誘導的第1D，不同氧濃度下兩組細胞都處于生長潛伏期，增殖速度無明顯差異P005；第3D起兩組細胞增殖明顯，且低氧組明顯高于常氧組P005，顯示低氧對PMSCS誘導早期的增殖是有促進作用的。③實時熒光PCR顯示PMSCS誘導培養(yǎng)3D時誘導組較對照組SOX9基因表達有明顯差異P005；7D后SOX9，COLLAGENⅡ和AGGRECAN基因相對表達量在常氧組和低氧組都較非誘導組有顯著增加P結(jié)論①人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞在體外可成功培養(yǎng)并大量擴增，生物學性狀穩(wěn)定，是組織工程優(yōu)良的種子細胞來源之一。②本實驗在單層培養(yǎng)條件下，成功將人胎盤間充質(zhì)干細胞誘導分化成類髓核細胞，低氧能夠促進其分化效應(yīng)。

簡介：ZHEJIANGSCITECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATIONSTUDYONDOUBLESTRANDEDRNAVIRUSESINFECTINGRADISHTISSUECULTURE，CELLANDMOLECULARBIOLOGYOFVIRALINFECTEDSEEDLINGSQIANZHUOMAODIRECTEDBYDRCHENJISHUANG，PROFESSORDRHONGJIAN，PROFESSORHANGZHOU，CHINA課題來源國家自然基金項目116152A4A09631資助

簡介：THEBIOLOGICALCHARACTERISTICSANDMOLECULARMECHANISMOFCATHEPSINZANDCD97INGASTRIC?■■■CANCERCE兒LLNESANDCLIMCAUTHOR’SSIGNATURED●■‘SUPEMSOR7SSIGNATURETHESISREVIEWER1硼1ESISREVIEWER2THESISREVIEWER3THESISREVIEWER4THESISREVIEWER5⑧／廠而州乙A9～／T廠ANONYMOUSCHAIRZHANGSUZHAN，PROFESSORTHESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCOMMITTEEOFORALDEFENCECOMMITTEEMAN1J沌YULIAN，PROFESSOR，THESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCOMMITTEEMAN2．CAIJIANTING，PROFESSOR，THESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCAOLIPING，PROFESSOR，THESHAOYIFUAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCOMMITTEEMAN4．SHAOQINSHU，CHIEFPHYSICIAN，ZHEJIANGPROVINCEPEOPLE’SHOSPITALDATEOFORALDEFENCE2016．5．26浙江大學博士學位論文致謝致謝時間如梭，轉(zhuǎn)眼畢業(yè)在即?；叵朐谡憬髮W求學的過程，心中充滿了無限感激和留戀之情。感謝母校為我們提供良好的學習環(huán)境，使我們能夠在此專心學習。在此，謹向我的恩師陳力教授致以最誠摯的謝意在我攻讀博士學位期間，從論文選題、思路分析、實驗實施、論文撰寫的全過程中都得到了恩師悉心的指導和幫助。陳老師精益求精的工作態(tài)度、嚴謹務(wù)實的科研作風、謙虛寬忍的道德人品是我學習的榜樣。衷心感謝劉達人和李國剛在我畢業(yè)論文設(shè)計及寫作過程中所給予的耐心指導和無私幫助另外，我必須感謝李曉文等師兄弟、師妹在學習、實驗中給予的幫助和支持，正是因為他們在各方面的無私幫助，我才能得以順利完成該論文。感謝在學習、工作、生活中所有曾經(jīng)關(guān)心幫助和支持鼓勵我的老師、同學。我要衷心感謝我的父母。焉得諼草，言樹之背，養(yǎng)育之恩，無以回報。作為他們的孩子，我秉承了他們樸實、堅韌的性格，也因此我有足夠的信心和能力戰(zhàn)勝前進路上的艱難險阻；也因為他們的日夜辛勞，我才有機會如愿完成自己的學業(yè)。最后，我要感謝我的妻子及女兒多年來對我的理解和無私奉獻感恩之情，難以言表，謹致敬意。

簡介：鋁誘導不同耐鋁型速生桉無性系的鋁誘導不同耐鋁型速生桉無性系的根尖細胞生物學響應(yīng)機制研究根尖細胞生物學響應(yīng)機制研究陸明英陸明英二○一四年六月碩士學位碩士學位論文碩士論文論文鋁誘鋁誘導不導不同耐同耐鋁型鋁型速生速生碩士學位碩士學位論文碩士論文鋁誘導不同耐鋁型速生桉無性的系根尖細胞生物學響應(yīng)機制研究II廣西大學學位論文廣西大學學位論文原創(chuàng)性原創(chuàng)性和使用授權(quán)使用授權(quán)聲明聲明本人聲明所呈交的論文，是本人在導師的指導下獨立進行研究所取得的研究成果。除已特別加以標注和致謝的地方外，論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大學或其它單位的學位而使用過的材料。與我一同工作的同事對本論文的研究工作所做的貢獻均已在論文中作了明確說明。本人在導師指導下所完成的學位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬廣西大學。本人授權(quán)廣西大學擁有學位論文的部分使用權(quán)，即學校有權(quán)保存并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交學位論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或其它復制手段保存、匯編學位論文。本學位論文屬于□保密，在年解密后適用授權(quán)?！醪槐Ｃ堋Ｕ堅谝陨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打“√”論文作者簽名日期指導教師簽名日期作者聯(lián)系電話電子郵箱

簡介：口腔頜面部鱗癌預后分析及口腔頜面部鱗癌預后分析及HCPT對FADU細胞細胞生物學行為的影響生物學行為的影響趙振彥學號4062014269培養(yǎng)類別全日制學位類型專業(yè)學位一級學科專業(yè)類口腔醫(yī)學二級學科專業(yè)口腔頜面外科研究方向頜面腫瘤指導教師孫沫逸教授（主任醫(yī)師）培養(yǎng)單位口腔醫(yī)院口腔頜面外科二O一七年五月UDC616606密級公開第四軍醫(yī)大學碩士學位論文目錄縮略語表1中文摘要2英文摘要5前言9文獻回顧11正文24第一部分晚期口腔鱗癌預后相關(guān)因素分析241材料和方法2411病例信息的獲取與納入2412隨訪2513統(tǒng)計方法252結(jié)果2521納入患者的臨床信息2522總體生存曲線和總體生存率2623影響晚期口腔鱗癌患者生存的因素分析2724預后相關(guān)獨立危險因素生存曲線2825化療毒副作用293討論29第二部分諾謨圖預測舌鱗狀細胞癌遠期總體生存率和腫瘤特異性生存率的相關(guān)研究321材料3211病例信息的獲取與納入3212納入數(shù)據(jù)的分析及構(gòu)建諾謨圖3313諾謨圖的驗證和校準352結(jié)果35

簡介：研究背景由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學難題。對于從根本上提高其治療效果而言明確骨形成、重建、塑形的病理生理學特點及其生物學機制是其基礎(chǔ)和出發(fā)點。骨組織是一種伴隨著細胞外基質(zhì)礦化、根據(jù)需要不斷自我修復的復雜動態(tài)組織亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織因此骨折修復過程中既有機體多種組織、細胞因子之間錯綜復雜的協(xié)同作用更與血液供應(yīng)、神經(jīng)支配密切相關(guān)其修復區(qū)域內(nèi)環(huán)境的生物學穩(wěn)定性尤其是血液供應(yīng)和神經(jīng)支配的重建是關(guān)鍵因素。血液供應(yīng)的重建對于骨及移植物保持生物學活性的重要性已被眾多實驗及臨床實踐所證實除此之外骨組織再生中神經(jīng)因素可能同樣發(fā)揮著重要作用。在早期進行的骨發(fā)育學研究顯示一些先天顱面發(fā)育缺陷疾病常常伴有神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的現(xiàn)象提示神經(jīng)系統(tǒng)對骨發(fā)育支配和調(diào)節(jié)的重要性。再者眾多解剖學、神經(jīng)生物學以及臨床實踐研究均已證實神經(jīng)因素對骨折愈合、骨修復具有確切的生物調(diào)節(jié)作用。但是目前對神經(jīng)因素調(diào)控骨組織再生的生物學機制研究較少。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)植入感覺神經(jīng)能夠促進組織工程骨成骨及修復骨缺損且骨再生區(qū)域的神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY含量明顯增加提示我們神經(jīng)肽類物質(zhì)在骨折愈合、重建中可能起到重要作用可能是神經(jīng)發(fā)揮其調(diào)控作用的關(guān)鍵因素。近年來神經(jīng)肽類物質(zhì)在骨折愈合、骨組織再生中的重要作用已逐漸得到人們的重視并成為國內(nèi)、外學者新的研究熱點之一。神經(jīng)肽是神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的具有神經(jīng)調(diào)節(jié)活性的肽類物質(zhì)具有廣泛的生物學效應(yīng)其中降鈣素基因相關(guān)肽CALCITONINGENERELATEDPEPTIDECGRP、P物質(zhì)SUBSTANCEPSP、神經(jīng)肽YNEUROPEPTIDEY是最具代表性的物質(zhì)。CGRP和SP是感覺神經(jīng)纖維分泌的兩種主要神經(jīng)肽NPY是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高、分布最廣的神經(jīng)肽之一介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的重要因子。目前的研究多局限在神經(jīng)肽對成骨細胞的影響對成骨細胞的前體細胞骨髓基質(zhì)干細胞BONEMARROWSTEMCELLSBMSCS的研究較少。BMSCS具有強大的增殖能力和多向分化潛能在骨代謝中扮演著重要角色在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、基質(zhì)細胞和造血細胞等多種細胞是骨組織工程研究領(lǐng)域的理想種子細胞。因此闡明神經(jīng)肽對BMSCS的具體作用有助于我們更好的了解神經(jīng)肽在骨代謝過程中發(fā)揮的作用進一步揭示骨再生過程中的神經(jīng)生物學作用機制。本實驗通過BMSCS的體外培養(yǎng)從細胞學角度采用免疫組織化、細胞遷移、PCR和WESTERNBLOT等方法對神經(jīng)肽及其受體在BMSCS中的表達與生物學效應(yīng)進行研究為進一步深入研究骨再生、骨代謝過程中的神經(jīng)生物學調(diào)節(jié)分子轉(zhuǎn)導機制奠定堅實基礎(chǔ)同時也可為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應(yīng)用提供新的思路和實驗依據(jù)。研究目的1明確神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體在BMSCS及其成骨分化中的表達趨勢。2明確神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY調(diào)控BMSCS增殖的作用及其機制。3初步探明神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY在BMSCS成骨分化中的生物學效應(yīng)及機制。4初步探明神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS遷移的作用。研究方法1BMSCS及其成骨分化過程中神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體的表達檢測采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分別使用流式細胞儀檢測和免疫細胞化學對BMSCS表型標志物和成骨分化進行鑒定取第2代BMSCS用于實驗。分為誘導成骨組及未誘導組在BMSCS傳代第2代培養(yǎng)的不同時期1、2、3W采用REALTIMERTPCR、WESTERNBLOT檢測細胞CGRP、SP、NPY受體MRNA及蛋白表達。2神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS增殖的調(diào)控作用及其機制研究將活力大于95％的大鼠第2代BMSCS細胞以104孔密度種于96孔細胞培養(yǎng)板細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基24小時使細胞同步化于G0期。后以CGRP108MOLLSP108MOLLNPY50NM分別刺激1357D采用MTT法測定OD值繪制細胞生長曲線；采用RTPCR、WESTERNBLOT檢測細胞周期調(diào)控蛋白的表達。3神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS成骨分化的作用及相關(guān)生物學機制研究將CGRP108MOLLSP108MOLLNPY50NM分別作用于傳代第3代培養(yǎng)的BMSCS常規(guī)培養(yǎng)組作為對照于不同時間點1、7、14、21D應(yīng)用WESTERNBLOT比較分析BMSCS中成骨細胞特征性物質(zhì)ALP、BGP合成情況；應(yīng)用免疫細胞化學、WESTERNBLOT對細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的表達進行檢測分析。4神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS遷移的作用及其機制研究應(yīng)用REALTIMERTPCR、WESTERNBLOT檢測血管細胞細胞粘附分子VCAM1表達對神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY影響B(tài)MSCS粘附及遷移作用機制進行初步分析；利用細胞劃痕實驗、趨化實驗對神經(jīng)肽作用BMSCS后的遷移能力進行檢測。5統(tǒng)計學方法計量資料以X±S表示選取檢驗水準A005采用SPSS130統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。TRANSWELL細胞趨化實驗數(shù)據(jù)采用多樣本均數(shù)比較的方差分析ONEWAYANOVA進行統(tǒng)計學分析經(jīng)LEVENE檢驗滿足方差齊性后組間比較以LSD方法為準方差不齊的數(shù)據(jù)以近似方法DUNT3分析結(jié)果為準。BMP2、VEGF表達的WESTERNBLOT檢測中同一時間點多個組間的數(shù)據(jù)采用ONEWAYANOVA進行統(tǒng)計學分析經(jīng)LEVENE檢驗滿足方差齊性后組間比較以LSD方法為準方差不齊的數(shù)據(jù)以近似方法DUNT3分析結(jié)果為準；同組兩個時間點之間的數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本T檢驗并檢驗其方差齊性。其他實驗數(shù)據(jù)均采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析；當資料滿足球形假設(shè)時以SPHERICITYASSUMED方法為準。當資料不滿足球形假設(shè)時需用Ε校正系數(shù)來校正自由度。對有顯著意義的主效應(yīng)進行多重比較采用LSD法。對同一時間點多組別的比較采用ONEWAYANOVA進行分析同一組不同時間點的數(shù)據(jù)比較采用重復測量的方差分析經(jīng)LEVENE檢驗數(shù)據(jù)滿足方差齊性以LSD方法為準方差不齊的數(shù)據(jù)以近似方法DUNT3分析結(jié)果為準。結(jié)果1BMSCS及其成骨分化過程中神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體的表達檢測11BMSCS的分離和鑒定全骨髓培養(yǎng)的第2代BMSCS表面標志物鑒定結(jié)果分別為CD2996％、CD44959％CD4529％、CD3426％；免疫細胞化學結(jié)果顯示成骨細胞誘導7D后ALP染色陽性COLⅠ染色陽性；成骨誘導14D后BGP染色陽性COLⅢ染色陰性。WESTERNBLOT檢測結(jié)果顯示各時間點的成骨誘導組與未誘導組相比ALP、BGP、COLⅠ蛋白含量隨誘導時間依次增高COLⅢ隨誘導時間下降因此本實驗獲取的BMSCS具有干細胞特性采用適當方法可誘導其向成骨細胞分化。12BMSCS成骨分化過程中神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY受體的表達CGRP受體的表達REALTIMERTPCR結(jié)果顯示同一時間點誘導組CGRP受體MRNA表達量高于未誘導組誘導組CGRP受體MRNA表達以時間依賴性的方式不斷增高；WESTERNBLOT結(jié)果顯示同一時間點誘導組CGRP受體的蛋白水平高于未誘導組誘導組CGRP受體蛋白水平以時間依賴性的方式增高。SP受體的表達BMSCS及其誘導的成骨細胞有SP受體表達；SP受體MRNA在誘導1周時下降在誘導至3周時顯著增高；同一時間點誘導組SP受體的蛋白水平高于未誘導組誘導組SP受體蛋白水平在第3周時顯著增高呈明顯的時間依賴性。NPY受體的表達REALTIMERTPCR結(jié)果顯示同一時間點誘導組Y1受體MRNA表達量低于未誘導組誘導組和未誘導組Y1受體MRNA表達均以時間依賴性的方式增高。WESTERNBLOT結(jié)果顯示同一時間點誘導組Y1受體的蛋白水平高于未誘導組誘導組和未誘導組Y1受體蛋白水平以時間依賴性的方式減少。2神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS增殖的調(diào)控作用及其機制研究21神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS增殖作用大鼠BMSCS在三種神經(jīng)肽干預的不同時間點之間OD值均有顯著性差異F143271P22細胞增殖相關(guān)調(diào)控基因表達檢測采用WESTERNBLOT技術(shù)檢測CGRP、SP、NPY對BMSCS細胞周期素CYCLIND1、CYCLINEP53基因蛋白表達的影響。CGRP組中CYCLIND1蛋白表達在第5D時達到高峰與對照組比較增高明顯有統(tǒng)計學意義P3神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS成骨分化的作用及相關(guān)生物學機制研究31成骨細胞特征性物質(zhì)合成檢測WESTERNBLOT檢測結(jié)果使用成骨誘導培養(yǎng)基的條件下采用不同濃度的CGRP、SP、NPY作用于BMSCS在7、14、21D均明顯促進ALP和BGP的蛋白表達量同一時間的神經(jīng)肽作用組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義P32BMP2、VEGF表達檢測免疫細胞化學染色結(jié)果顯示在神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY作用后的5、7DBMP2、VEGF染色陽性胞質(zhì)呈棕色。WESTERNBLOT結(jié)果顯示第5天、第7天的三種神經(jīng)肽組與對照組相比BMP2蛋白表達增加明顯四組間差異有統(tǒng)計學意義第5天F292722P第5天的三種神經(jīng)肽與對照組相比VEGF蛋白表達增加明顯四組間差異有統(tǒng)計學意義F429338P4神經(jīng)肽CGRP、SP、NPY對BMSCS遷移的作用及其機制研究41細胞劃痕實驗觀察結(jié)果與對照組相比三種神經(jīng)肽均能不同程度的促進BMSCS遷移其中以SP組7、9D的作用最強細胞遷移的總距離和速度明顯增加。42TRANSWELL細胞趨化實驗結(jié)果對照組、CGRP組、SP組、NPY組刺激組細胞遷移數(shù)分別為111±049、320±177、478±177、486±096個高倍鏡視野各神經(jīng)肽作用組與對照組比較細胞遷移數(shù)目增加四組間差異有統(tǒng)計學意義F20021P43VCAM1的RTPCR檢測大鼠BMSCS在CGRP干預的不同時間點VCAM1MRNA表達均有顯著性差異F484012P結(jié)論1BMSCS表達CGRP、SP、NPY受體在成骨分化過程中各種受體的表達趨勢各異可能與其在骨重建過程中的不同介導作用有關(guān)。2CGRP、SP、NPY對BMSCS的增殖有直接促進作用通過影響CYCLIND1、CYCLINE、P53等細胞周期相關(guān)蛋白的表達是其可能的作用機制。3CGRP、SP、NPY促進BMSCS向成骨細胞分化影響成骨特征性蛋白的表達是其可能的作用機制之一。4CGRP、SP、NPY在調(diào)控BMSCS成骨分化的同時顯著提高BMP2、VEGF的蛋白表達。5CGRP、SP、NPY作用后能誘導BMSCS的遷移對其具有趨化作用。6CGRP、SP、NPY可能通過對BMSCS增殖、分化及遷移的調(diào)控影響骨再生及重建。

簡介：研究背景紫外線ULTRAVIOLETUV是電磁波譜中波長為100～400NM的輻射的總稱人類社會活動中接觸到的紫外線主要來源于太陽輻射和一些人工光源其中來自太陽的紫外線約占太陽光譜的5％。根據(jù)紫外線的波長和生物學效應(yīng)的不同可以分為3個波段長波紫外線UVALONGWAVEULTRAVIOLET320～400NM能穿透人類皮膚真皮層；中波紫外線UVB290～320NM可穿透皮膚幾毫米；短波紫外線UVCSHTWAVEULTRAVIOLET200～290NM穿透力較弱是紫外線輻射殺菌的主要部分。由于地球上方臭氧層的阻擋和過濾作用使太陽紫外線中全部的UVC和大部分UVB被屏蔽從而使到達地球表面的紫外線絕大部分的是UVA約占9099％和少量的UVB約占110％盡管UVB的含量較低但是UVB的致癌能力卻是UVA的1000到10000倍。UVB是已經(jīng)被確認的自然環(huán)境中的環(huán)境致癌因子臭氧空洞的形成和擴大使得到達地球表面的紫外線輻射量尤其是IYVB較以往增多隨之而來的皮膚疾病和皮膚癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢全球范圍內(nèi)每年新增大約2500000例非黑素瘤皮膚癌患者和132000例惡性黑素瘤患者在日光下的慢性照射是基底細胞癌BCCS和鱗狀細胞癌SCCS發(fā)生的主要原因BCCS和SCCS同樣都發(fā)病于皮膚基底層SCCS具有侵襲性超過10％的SCCS能夠發(fā)生遷移而BCCS不會發(fā)生遷移但是其在局部具有較強的侵襲性和毀壞性。目前對UVB致皮膚損傷機制的研究已經(jīng)是國內(nèi)及國際學術(shù)界和醫(yī)療界的熱點問題。皮膚是人體最大的器官覆蓋于機體表面在對抗外界環(huán)境的物理、化學和生物等刺激時起到機械屏障和保護作用皮膚的角質(zhì)細胞還參與各種細胞生物學進程如免疫、炎癥、增生以及腫瘤轉(zhuǎn)化等同時又與體內(nèi)各臟器有著緊密的聯(lián)系從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。正因為皮膚裸露于外環(huán)境中它比其它器官接受更多來自外界環(huán)境紫外線的輻射角質(zhì)層處在皮膚的最外層角質(zhì)形成細胞占表皮細胞的90％以上是UVB作用的主要靶細胞照射到皮膚的紫外線95％的被角質(zhì)細胞所吸收。而環(huán)境中UVB的增加無疑會加重對皮膚角質(zhì)細胞的損傷引起皮膚的紅斑、炎癥甚至皮膚癌等。UVB對DNA有直接的損傷作用并能誘導細胞發(fā)生細胞周期阻滯CELLCYCLEARREST。UVB還是一種重要的氧化應(yīng)激OXIDATIVESTRESS因素UVB輻射產(chǎn)生的活化氧簇REACTIVEOXYGENSPECIESROS可破壞皮膚的酶及非酶性抗氧化防御系統(tǒng)使機體易受損造成皮膚老化、皮膚腫瘤等病理狀態(tài)。目前認為ROS在UVB誘導的細胞周期阻滯和凋亡中發(fā)揮重要的作用。研究目的UVB被認為是誘發(fā)皮膚癌的主要因素皮膚癌起始于皮膚角質(zhì)化細胞因此研究UVB致皮膚角質(zhì)化細胞損傷的機理具有十分重要的意義。本研究通過觀察UVB輻射對HACAT細胞損傷的生物學效應(yīng)深入探討UVB致皮膚損傷的機理并與A431細胞比較分析不同種類細胞對UVB輻射不同的生物學反應(yīng)；另外我們初步探討紅景天苷在UVB誘導細胞細胞壞死和凋亡中的作用為皮膚癌的光化學預防和治療尋找新的天然藥物。研究方法1用不同劑量0、10、30、50、70、100JM2的UVB分別照射HACAT細胞和A431細胞并繼續(xù)培養(yǎng)24H后MTT法檢測細胞存活率；用50JM2劑量UVB照射HACAT細胞和A431細胞后繼續(xù)培養(yǎng)在照后不同培養(yǎng)時間2、4、8、12、24H使用MTT法檢測細胞存活率觀察比較兩種細胞存活率的變化。2應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測50JM2的UVB照射后培養(yǎng)至12H的HACAT細胞和A431細胞周期的變化分析UVB對細胞周期的影響及與凋亡的關(guān)系。3用RTPCR和WESTERNBLOT法分別從RNA水平和蛋白水平檢測UVB照射后HACAT細胞和A431細胞在不同時間點2、4、8、12、24HNFKB、BCL2和CDK6的表達情況探討NFKB信號通路及相關(guān)蛋白在UVB誘導的細胞損傷中的作用。4應(yīng)用MTT法檢測不同濃度100、300、500ΜGML紅景天苷預處理的HACAT細胞和A431細胞在UVB照射后24H的存活率并與陽性對照組比較探討紅景天苷的對細胞是否存在保護或者殺傷的藥效作用。研究結(jié)果1UVB對HACAT細胞和A431細胞存活率的影響存在時間依賴性和劑量依賴性隨著UVB照射劑量的增加細胞存活率逐漸降低；50JM2劑量的UVB照射后隨著培養(yǎng)時間的增加細胞的存活率逐漸降低但A431細胞在24H時間點的存活率略有回升。在兩種細胞之間不同劑量照射后培養(yǎng)24H的細胞存活率沒有顯著差異；50JM2劑量照射后培養(yǎng)不同時間的MTT結(jié)果表明兩種細胞在UVB照射后4H和8H的存活率沒有顯著差異P005在此之前的2H時間點A431存活率略高于HACAT細胞P2HACAT細胞經(jīng)50JM2照射后12H發(fā)生G0G1期阻滯并且出現(xiàn)明顯的凋亡峰。而在A431細胞中細胞周期分布基本沒有改變。3在HACAT細胞中UVB照射能夠誘導NFKB信號通路的激活上調(diào)NFKBP65的表達與對照組相比在8H有顯著性差異并持續(xù)高表達至24H同時UVB照射也能夠引起B(yǎng)CL2和CDK6基因的高表達；在A431細胞中有與上述相似的結(jié)果。4在紅景天苷藥效學的研究中紅景天苷對A431細胞和HACAT細胞在UVB照射后的影響對于A431細胞單純UVB照射組細胞的存活率低于陽性對照組P005說明紅景天苷藥物對細胞沒有毒性作用；在50JM2UVB照射并給予不同劑量的紅景天苷處理的細胞中隨著紅景天苷應(yīng)用劑量的增加細胞存活率呈下降趨勢單獨照射UVB組與UVB500ΜGML紅景天苷組有顯著性差異P結(jié)論1UVB誘導HACAT細胞和A431細胞損傷具有時間依賴性和劑量依賴性UVB誘導的生物學效應(yīng)與細胞的種類有關(guān)不同種類細胞對UVB照射的生物學反應(yīng)不同。2NFKB信號通路可能參與UVB誘導的細胞損傷應(yīng)答并與同樣高表達的BCL2、CDK6之間存在一定的聯(lián)系；在A431細胞中有與HACAT細胞相似的結(jié)果這些基因和蛋白能夠為皮膚癌的治療提供新的靶點。3紅景天苷聯(lián)合UVB照射能夠降低細胞存活率提示紅景天苷具有光致敏作用或者其他活性作用紅景天苷有可能成為皮膚癌化學治療和預防的新藥物。

簡介：目的探討用豬小腸粘膜下層SMALLINTESTINALSUBMUCOSA，SIS作支架，復合骨髓間充質(zhì)干細胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSC與由BMSC誘導而來的成骨細胞在體外構(gòu)建組織工程化生物活性骨膜的可行性，并研究種子細胞的生物學特性。方法以常規(guī)方法培養(yǎng)BMSC，并在條件培養(yǎng)基下誘導為成骨細胞，再分別與SIS進行體外復合培養(yǎng)，對兩種細胞分別進行生物學特性檢測，包括生長曲線繪制，流式細胞周期分析、表型鑒定。并對兩種細胞復合而成的生物活性骨膜進行倒置顯微鏡、掃描電鏡及骨鈣素，堿性磷酸酶，I型膠原的WESTERNBLOT檢測。從而判斷BMSC及誘導的成骨細胞在SIS上的生長、分化、增殖及細胞分泌細胞外基質(zhì)的情況。結(jié)論SIS與BMSC及誘導的成骨細胞在體外復合培養(yǎng)可以構(gòu)建出生物活性骨膜，BMSC與誘導的成骨細胞在SIS上維持了正常的生物學特性，兩者均顯示了與SIS支架材料良好的組織相容性，且兩者在成骨活性表達上存在差異，與誘導的成骨細胞復合的SIS表現(xiàn)出了更為活躍的成骨活性，這為進一步研究以組織工程化生物活性骨膜修復骨缺損打下堅實的基礎(chǔ)。

簡介：骨性關(guān)節(jié)炎OSTEOARTHRITIS，OA是一種好發(fā)于中老年人的慢性進行性骨關(guān)節(jié)病。它是一種以軟骨退行性變?yōu)楹诵?，累及骨質(zhì)，包括滑膜，關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)囊外其他結(jié)構(gòu)的不同程度的炎性病變。隨著我國人口老齡化和OA發(fā)病趨勢年輕化，OA逐漸成為危害人類健康和生存質(zhì)量的重要疾病。對OA發(fā)生和發(fā)展機制的研究也已成為骨科領(lǐng)域研究的重點。研究顯示無論何種原因引發(fā)的OA多伴有關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境失衡，滑膜及其細胞是其主要因素。目的建立滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系，構(gòu)筑類OA微環(huán)境，探討滑膜細胞在OA發(fā)生中的作用，為OA發(fā)病機理研究提供依據(jù)。方法⑴采用改良的HULTH法復制兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶，術(shù)后4周關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生明顯，獲得大量滑膜組織。⑵用胰蛋白酶Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法分離滑膜細胞進行原代與傳代培養(yǎng)，觀察滑膜細胞形態(tài)、活性，進行CD68免疫組化鑒定。⑶采用兩步酶消化法從正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織獲取軟骨細胞，進行原代、傳代培養(yǎng)及細胞學觀察；⑷建立滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系，將原代和傳代滑膜細胞分別以不同的比例11，112，114，118分別與軟骨細胞細胞數(shù)為4104個共培養(yǎng)，以正常軟骨細胞組為對照組，觀察原代及傳代滑膜細胞微環(huán)境對軟骨細胞形態(tài)及生物學活性的影響。⑸采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)REVERSETRANASEPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR方法檢測共培養(yǎng)10天和20天時原代及傳代滑膜細胞微環(huán)境對各組軟骨細胞在RNA水平上，Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達的影響。結(jié)果①改良HULTH法復制膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，造模4周關(guān)節(jié)腫脹，滑膜組織增生明顯，襯覆滑膜細胞層數(shù)增加，間質(zhì)纖維組織增生，軟骨表面裂隙或纖維化，軟骨細胞呈小灶性壞死。②胰蛋白酶Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法可培養(yǎng)獲得大量滑膜細胞且細胞活性大于98％，巨噬細胞樣滑膜細胞CD68免疫組化染色陽性。③胰蛋白酶Ⅰ型膠原酶Ⅱ型膠原酶聯(lián)合酶消化法可成功分離并獲得大量高活性軟骨細胞。④以滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系構(gòu)筑了滑膜細胞微環(huán)境，滑膜細胞數(shù)量、培養(yǎng)時間與軟骨細胞形態(tài)及增殖活性密切相關(guān)，滑膜細胞數(shù)量越多、作用時間越長，軟骨細胞增殖活性越低。⑤滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系中，滑膜細胞數(shù)量、代次與Ⅱ型膠原及蛋白多糖基因表達密切相關(guān)。共培養(yǎng)的軟骨細胞基因表達明顯下調(diào)，原代滑膜細胞作用強于傳代滑膜細胞；滑膜細胞數(shù)量越高，軟骨細胞基因表達越低。結(jié)論⑴改良HULTH造模法可迅速形成骨性關(guān)節(jié)炎，使滑膜組織在短時間內(nèi)增生明顯，襯覆滑膜細胞層數(shù)增加，間質(zhì)纖維組織增生，獲得大量的滑膜組織，解決了滑膜取材難的問題。該法適用于提取滑膜組織和OA發(fā)病機制的研究。⑵聯(lián)合酶消化法可分離獲取滑膜細胞、軟骨細胞，實驗操作簡單、快捷，細胞貼壁快且細胞活性率較高，可在短時間內(nèi)為實驗研究提供大量目標細胞，為實驗的進一步研究提供了方便。⑶構(gòu)筑的滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)體系適用于OA微環(huán)境的研究，且該體系可模擬類OA關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境，適用于研究軟骨損傷的進程。⑷滑膜及滑膜細胞的結(jié)構(gòu)和功能與關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境的平衡密切相關(guān)，這種微環(huán)境的失衡可導致軟骨細胞結(jié)構(gòu)和功能學活性的改變，可為OA發(fā)病的重要因素之一。

簡介：分類號S8312學校代碼10129UDC6365學號2010301017北京油雞胚胎肝臟來源間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性研究ISOLATIONBIOLOGICALACTERIZATIONOFMESENCHYMALSTEMCELLSFROMBEIJINGFATTYCHICKENFETALLIVER申請人牧仁學科門類農(nóng)學學科專業(yè)基礎(chǔ)獸醫(yī)學研究方向動物分子病理學指導教師王鳳龍教授關(guān)偉軍教授論文提交日期二〇一三年六月標志物的表達量變化規(guī)律，證明高代次的細胞相較于低代次的細胞分化細胞標志物均出現(xiàn)表達量下調(diào)的趨勢，說明低代次的細胞在體外更易被誘導分化，細胞隨傳代次數(shù)的增加，細胞的分化能力在減弱。實驗證明由7D雞胚胎肝所分離的MSCS為多潛能間充質(zhì)干類型的干細胞。研究表明本研究從北京油雞胚胎肝臟所分離得到的間充質(zhì)干細胞符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性，細胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境中最多傳代達25代，液氮保存的細胞在復蘇后可傳代培養(yǎng)并保持雞胎肝MSCS的生物學特性。雞MSCS能在體外誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、神經(jīng)元和心肌細胞。本研究初步建立了雞胎肝MSCS分離培養(yǎng)及鑒定的方法及試驗流程。關(guān)鍵詞北京油雞；間充質(zhì)干細胞；細胞培養(yǎng)；增殖能力；誘導分化

簡介：目的TBC1D3又稱PRC17（前列腺癌基因17），是人科特有的癌基因，高表達于多種腫瘤細胞，如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和骨髓增生異常綜合征等。TBC1D3的表達可使正常成纖維細胞NIH3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，亦可延遲EGFR和IRS1的降解來增強GFS信號，導致細胞增殖和腫瘤發(fā)生。GFS信號負反饋調(diào)節(jié)TBC1D3的穩(wěn)定性，在E3泛素連接酶CUL7的介導下泛素化和降解TBC1D3，使得TBC1D3的蛋白水平維持動態(tài)平衡。鈣調(diào)蛋白CAM參與眾多蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，如雌激素受體ΑERΑ和TRE17USP6等，我們的預實驗顯示CAM通過抑制TBC1D3的降解提高其穩(wěn)定性。因此，探討CAM調(diào)節(jié)TBC1D3穩(wěn)定性的機制，將有助于闡明CAM和TBC1D3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為腫瘤的診斷和防治提供新線索。方法1為了研究CAM對TBC1D3降解的調(diào)節(jié)作用，我們轉(zhuǎn)染GSTCAM使CAM高表達或使用CAM抑制劑W7抑制內(nèi)源性CAM功能，通過WESTERNBLOT和免疫共沉淀實驗分別觀察MCF7和BT549細胞內(nèi)CAM對TBC1D3降解和泛素化的調(diào)節(jié)作用。通過抽提細胞漿、細胞核蛋白，觀察TBC1D3降解的亞細胞部位及CAM的調(diào)節(jié)作用。2為了探討CAM抑制TBC1D3降解的機制是否通過相互作用，以GST載體為對照，將GSTCAM和FLAGTBC1D3復合轉(zhuǎn)染MCF7細胞，用抗GST抗體進行免疫共沉淀，檢測CAM與TBC1D3之間的相互作用以FLAG載體為對照，將FLAGTBC1D3和GSTCAM復合轉(zhuǎn)染MCF7細胞，用抗FLAG抗體進行免疫共沉淀，反向檢測TBC1D3與CAM之間的相互作用使用CA2螯合劑EGTA處理，通過免疫共沉淀分別觀察MCF7和BT549細胞內(nèi)CAM與TBC1D3的相互作用OVERLAPPCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)在缺失突變體FLAGTBC1D3△157171和FLAGTBC1D3△303312，以FLAG為對照，分別將GSTCAM和FLAGTBC1D3及其突變體復合轉(zhuǎn)染MCF7細胞，抗FLAG抗體做免疫共沉淀檢測它們與CAM的相互作用，以分析確定TBC1D3氨基酸序列中與CAM相互作用的功能部位以GST載體為對照，F(xiàn)LAGTBC1D3及其突變體與GSTCAM分別復合轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染MCF7細胞，抗GST抗體做免疫共沉淀，反向驗證TBC1D3氨基酸序列中與CAM相互作用的功能部位。3為了分析TBC1D3內(nèi)與CAM結(jié)合部位的功能，用OVERLAPPCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)點突變體FLAGTBC1D3Y163AT165A和FLAGTBC1D3K166R。分別轉(zhuǎn)染FLAGTBC1D3、FLAGTBC1D3△157171及點突變體，通過WESTERNBLOT和COIP檢測TBC1D3及點突變體的降解水平和泛素化水平以FLAG為對照，將FLAGTBC1D3及點突變體分別和GSTCAM復合轉(zhuǎn)染MCF7細胞，抗FLAG抗體做免疫共沉淀檢測它們與CAM的相互作用。4為了檢測TBC1D3的穩(wěn)定性對細胞遷移的作用，以FLAG空載體為對照，與FLAGTBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF7和BT549細胞，進行劃痕和TRANSWELL遷移實驗。為了探討TBC1D3影響細胞遷移的機制，F(xiàn)LAG空載體和FLAGTBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF7細胞，無血清饑餓24H后，明膠酶譜法檢測培養(yǎng)液內(nèi)MMP9活性實時熒光定量PCR和WESTERNBLOT分別檢測細胞裂解物內(nèi)MMP9的MRNA和蛋白水平。復合轉(zhuǎn)染GSTCAM，觀察CAM對TBC1D3穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用對細胞遷移、MMP9活性和蛋白水平的影響。結(jié)果1WESTERNBLOT結(jié)果表明10％FCS可誘導TBC1D3降解，復合轉(zhuǎn)染CAM并高表達時，10％FCS誘導的TBC1D3降解受到明顯抑制，說明CAM能夠抑制TBC1D3的降解使用W7抑制內(nèi)源性CAM功能后，TBC1D3的降解趨勢更加明顯，說明內(nèi)源性CAM在TBC1D3降解中的抑制作用免疫共沉淀實驗顯示10％FCS可有效誘導TBC1D3的泛素化，CAM的表達可大大降低TBC1D3的泛素化水平，說明CAM可以降低TBC1D3的泛素化水平細胞漿、細胞核蛋白抽提實驗顯示在MCF7細胞中，10％FCS刺激誘導TBC1D3降解既發(fā)生于細胞漿、也發(fā)生于細胞核且細胞核內(nèi)降解趨勢更加明顯復合轉(zhuǎn)染CAM并高表達時，TBC1D3細胞漿、細胞核內(nèi)降解受到明顯的抑制，均大大減少。在BT549細胞中，10％FCS刺激誘導的TBC1D3降解在細胞漿、細胞核內(nèi)均被檢測到且細胞漿內(nèi)降解趨勢更加明顯復合轉(zhuǎn)染CAM并高表達時，TBC1D3細胞漿、細胞核內(nèi)降解均受到明顯的抑制。2用抗GST抗體進行免疫共沉淀，GST對照組無TBC1D3結(jié)合條帶，GSTCAM組檢測到TBC1D3結(jié)合條帶，說明TBC1D3與CAM存在相互作用以抗FLAG抗體做反向免疫共沉淀，F(xiàn)LAG對照組無CAM結(jié)合條帶，F(xiàn)LAGTBC1D3組檢測到CAM結(jié)合條帶，說明CAM與TBC1D3存在相互作用使用EGTA螯合CA2后，以抗FLAG抗體或抗GST抗體做免疫共沉淀，均未檢測到TBC1D3與CAM的相互作用，提示CAM與TBC1D3的相互作用依賴于CA2環(huán)境。OVERLAPPCR構(gòu)建的TBC1D3缺失突變體FLAGTBC1D3△157171和FLAGTBC1D3△303312，經(jīng)BAMHⅠ和XHOⅠ雙酶切和測序鑒定，序列正確符合預期。以抗FLAG抗體或抗GST抗體做免疫共沉淀，結(jié)果均顯示157位171位氨基酸缺失后TBC1D3不能與CAM結(jié)合，提示TBC1D3蛋白序列上與CAM相互作用的部位可能在N端的157到171位氨基酸之間。3OVERLAPPCR構(gòu)建的TBC1D3點突變體FLAGTBC1D3Y163AT165A和FLAGTBC1D3K166R，經(jīng)BAMHⅠ和XHOⅠ雙酶切和測序鑒定，序列正確符合預期。WESTERNBLOT結(jié)果顯示10％FCS可誘導FLAGTBC1D3Y163AT165A降解，而FLAGTBC1D3△157171和FLAGTBC1D3K166R無明顯降解以抗FLAG抗體做免疫共沉淀檢測泛素水平，結(jié)果顯示FLAGTBC1D3Y163AT165A與FLAGTBC1D3均檢測到明顯泛素化，F(xiàn)LAGTBC1D3K166R泛素水平大大降低。以抗FLAG抗體做免疫共沉淀，結(jié)果顯示TBC1D3和TBC1D3K166R與CAM存在相互作用，F(xiàn)LAG對照和TBC1D3Y163AT165A無CAM結(jié)合條帶，提示CAM抑制TBC1D3的降解是通過與TBC1D3相互作用抑制K166的泛素化。4細胞劃痕和TRANSWELL遷移實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FLAGTBC1D3的MCF7和BT549細胞遷移能力明顯強于轉(zhuǎn)染FLAG空載體實時熒光定量PCR結(jié)果顯示TBC1D3可上調(diào)MMP9MRNA水平，WESTERNBLOT檢測顯示TBC1D3可上調(diào)MMP9蛋白水平，明膠酶譜實驗顯示TBC1D3可增強MMP9活性，提示TBC1D3促進乳腺癌細胞遷移可能是通過上調(diào)MMP9的蛋白和活性水平。復合轉(zhuǎn)染CAM時，TBC1D3上調(diào)的MMP9的蛋白和活性水平以及誘導的細胞遷移均被增強。結(jié)論1CAM增強人乳腺癌細胞漿、細胞核TBC1D3蛋白的穩(wěn)定性。2CA2CAM與TBC1D3的N端157位171位氨基酸序列相互作用。3泛素化位點K166突變增強人乳腺癌細胞內(nèi)TBC1D3蛋白的穩(wěn)定性。4CAM增強TBC1D3誘導的人乳腺癌細胞MMP9活性和細胞遷移。

簡介：目的對醫(yī)用生物材料進行表面形貌修飾可提高材料的生物相容性。目前鈦TITANIUMTI是最理想的口腔種植材料具有優(yōu)良的理化性質(zhì)和機械性能但其骨整合速度與質(zhì)量仍然不盡人意。探尋有效的鈦表面修飾方法進一步提高純鈦種植體的生物相容性是當前研究的熱點之一。本研究目的是在應(yīng)用嚴重塑性變形SEVEREPLASTICDEFMATIONSPD表面納米化技術(shù)使純鈦表面產(chǎn)生納米化結(jié)構(gòu)并觀察其對細胞生物學行為的影響從而為塑性變形納米化新材料的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。材料和方法將大小為10101MM3規(guī)格的12塊醫(yī)用純鈦板分為2組設(shè)未處理純鈦板為對照組NUMBER6塑性變形納米化純鈦板為實驗組NUMBER6。應(yīng)用SNCI金屬材料表面納米化試驗機在一定條件下對實驗組純鈦板進行塑性變形納米化處理60MIN得到6塊塑性變形納米化純鈦板。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀測塑性變形納米化材料表面形貌特征。以小鼠成骨細胞株MC3T3細胞為對象應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察MC3T3細胞在材料表面的黏附形態(tài)熒光顯微鏡檢測細胞黏附的數(shù)目流式細胞儀檢測細胞周期分布激光共聚焦掃描顯微鏡觀察和檢測細胞骨架肌動蛋白在不同時段的分布特點RTPCR法檢測Β1整合素和骨橋蛋白的MRNA水平。SAS60軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。結(jié)果醫(yī)用純鈦板在鋼球彈丸直徑8MM、振動頻率50HZ、真空和室溫條件下處理60MIN得到實驗所用納米化純鈦板材料。激光共聚焦顯微鏡顯示塑性變形納米化純鈦表面出現(xiàn)致密且不在一個層面的陷窩形成特殊的孔隙狀納米結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡下觀察表明塑性變形納米化純鈦板的表面結(jié)構(gòu)可以促進MC3T3細胞更好的伸展體積明顯增大呈扁平的多角形熒光顯微鏡顯示實驗組純鈦板表面細胞黏附能力優(yōu)于對照組純鈦板表面P＜005流式細胞儀結(jié)果顯示純鈦板表面納米化結(jié)構(gòu)對細胞周期分布無明顯影響激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)純鈦板表面納米化結(jié)構(gòu)能促進細胞骨架肌動蛋白纖維充分鋪展實驗組材料表面細胞的Β1整合素表達高于對照組P＜005實驗組細胞的骨橋蛋白表達與對照組無明顯差異P＞005。結(jié)論純鈦板表面通過嚴重塑性變形技術(shù)可以形成特殊的孔隙狀納米結(jié)構(gòu)此類表面結(jié)構(gòu)能明顯促進成骨細胞的黏附和鋪展產(chǎn)生這些表現(xiàn)的機制可能與促進Β1整合素表達有關(guān)。本研究說明純鈦板表面通過塑性變形技術(shù)處理后所獲得的結(jié)構(gòu)能提高鈦表面的生物相容性該技術(shù)有希望成為一種新的純鈦表面活性化處理技術(shù)。

簡介：牙周膜是一個自我更新的系統(tǒng)，牙周組織中存在一種原始的、可產(chǎn)生不同表型的間充質(zhì)干細胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS，后將其命名為牙周膜干細胞（PERIODONTALLIGAMENTSTEMCELLS，PDLSCS）。自2004年被發(fā)現(xiàn)以來，PDLSCS即引起口腔界地極大關(guān)注，它除具有干細胞基本特性外，還具有形成骨樣、牙骨質(zhì)樣及牙周韌帶樣結(jié)構(gòu)組織的特性，越來越多地研究證實PDLSCS在維持牙周組織動態(tài)平衡和缺損修復中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，PDLSCS被認為是牙周組織工程中最具有潛力的種子細胞。然而，PDLSCS的組織來源少，體外擴增極易老化，并且增殖活性和分化潛能受供體年齡和身體狀況等多種因素的影響，這使PDLSCS的研究應(yīng)用受到極大限制。干細胞生命活動受多種信號通路的調(diào)控，在不同的時間空間條件下，干細胞有絲分裂可能會走向老化、凋亡、分化等不同的命運。HIPPO信號通路是新近發(fā)現(xiàn)的一種與控制器官大小和腫瘤形成有關(guān)的蛋白激酶級聯(lián)通路，YAPYESASSOCIATEDPROTEIN是此通路中一個重要的信號蛋白，HIPPO上游分子主要通過調(diào)控YAP活性從而介導不同的生物學功能。YAP在多種組織干細胞和前體細胞中均見有高表達，在維持干細胞特性、促進細胞自我更新方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明HIPPO信號通路參與小鼠牙齒發(fā)育過程，改變牙源性上皮細胞YAP的表達會導致牙齒形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)的異常，目前尚未見YAP對PDLSCS作用的相關(guān)報導與研究。此外，HIPPO信號通路和與形態(tài)發(fā)生相關(guān)的TGFΒ、WRIT等信號通路存在多種交叉會話，各通路之間信號傳遞從而組成一種高度復雜而有序地的信息網(wǎng)絡(luò)，從而有序協(xié)調(diào)地調(diào)控細胞生長。目前關(guān)于PDLSCS的細胞生物學特性調(diào)控機制尚不十分明確。目的本實驗擬采用小干擾RNASMALLINTERFERINGRNA，SIRNA沉默人牙周膜干細胞HUMANPERIODONTALLIGAMENTSTEMCELLS，HPDLSCSYAP基因，研究YAP基因沉默對HPDLSCS增殖、凋亡及成骨向分化等生物學行為的影響。材料和方法1原代HPDLSCS的獲取經(jīng)酶解組織塊法分離、有限稀釋克隆法純化、流式細胞儀分析檢測細胞表面標記擴大培養(yǎng)。2設(shè)計并化學合成SIRNA序列，非特異性序列一條、人YAP靶向SIRNA序列三條，以脂質(zhì)體LIPOFECTAMIM2000為載體將SIRNA序列轉(zhuǎn)入HPDLSCS，分別設(shè)為NCNEGATIVECONTROL、SIRNA1、2、3組，僅使用LIPOFECTAMIM2000脂質(zhì)體干預組設(shè)為空白組。采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（REVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR）、蛋白質(zhì)印跡法WESTERNBLOT檢測轉(zhuǎn)染后YAP表達水平。3分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5天五個時間點，使用細胞增殖活性檢測試劑盒CCK8檢測YAPSIRNA對HPDLSCS增殖活性的影響于轉(zhuǎn)染后72H使用細胞周期檢測試劑盒流式檢測分析SIRNA干擾后細胞周期分布，并檢測YAP下游轉(zhuǎn)導細胞增殖與皮間轉(zhuǎn)化信號等相關(guān)的靶基因結(jié)締組織生長因子CONNECTIVETISSUEGROWTHFACT，CTGF表達水平。4于轉(zhuǎn)染后72H，使用細胞凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀檢測SIRNA干擾后細胞凋亡率的變化。5采用RTPCR技術(shù)檢測YAPSIRNA干擾后HPDLSCS成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN、ALP、COLLAGENⅠ的表達水平。6采用SPSS190軟件對數(shù)據(jù)進行處理，設(shè)P＜005為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果流式細胞儀檢測細胞表達表面標記MSCS表面標記CD73、CD44等98％～994％，造血干細胞表面標記CD45、HLADR等（028±0012％），本實驗分離培養(yǎng)獲得細胞為HPDLSCS在YAPSIRNA轉(zhuǎn)染后48小時，SIRNA1組、SIRNA2組與空白組和NC組相比，HPDLSCS的YAPMRNA和蛋白表達水平均明顯降低P＜001，且蛋白表達水平在被轉(zhuǎn)染后48、72小時之間無顯著差異，另外，這表明本實驗設(shè)計合成的SIRNA1、SIRNA2序列可以持續(xù)特異有效地抑制YAP的表達CCK8增殖活性實驗結(jié)果顯示SIRNA1、SIRNA2組細胞增殖活性受到明顯抑制，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示SIRNA1、SIRNA2組HPDLSCS細胞周期也發(fā)生改變G0G1及S期細胞比例增多P＜001、G2期細胞比例明顯減少P＜005，YAP下游靶基因CTGF蛋白表達量也降低流式細胞儀檢測細胞凋亡率顯示SIRNA1、SIRNA2組HPDLSCS早期及晚期凋亡率均增加YAPSIRNA轉(zhuǎn)染后HPDLSCS成骨相關(guān)基因COLLAGENⅠ、ALP、OCN的MRNA表達水平顯著升高，尤以O(shè)CN最為明顯。結(jié)論SIRNA沉默YAP基因后HPDLSCS增殖活性降低，細胞周期分布發(fā)生改變被阻滯于G0G1及S期，HPDLSCS凋亡率明顯增加，由此可見，HPDLSCS表達的YAP可促進HPDLSCS增殖并抑制凋亡。此外，細胞增殖活性的改變可能與細胞周期被阻滯、細胞凋亡率增加有關(guān)，我們還推測YAP下游靶基因CTGF在這一過程中介導重要功能但需進一步驗證在YAP基因沉默后HPDLSCS高表達成骨分化標志基因COLLAGENⅠ、ALP、OCN，其中OCN表達上調(diào)五倍，這表明YAP可能與HPDLSCS成骨方向分化有關(guān)。因此我們認為，YAP可能在HPDLSCS細胞生物學行為調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，YAP對HPDLSCS的作用及作用機制仍需要進一步的研究。