簡介：IIIMLLLLILULLLLLULLLIILLIIIY3345734中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文GANKYRIN對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和化療敏感性的影響及機(jī)制研究THEMECHANISMANDTHEEFFECTOFGANKYRINONTHEBIOLOGICALBEHAVIORANDCHEMOSENSITIVITYOFGASTRICCANCERCELLS論文作者萱墊些指導(dǎo)教師主廑整撞申請學(xué)位匿鱟擅±培養(yǎng)單位一級學(xué)科墮座匡堂二級學(xué)科壁疸堂研究方向中國醫(yī)科大學(xué)遼寧2017年10月摘要目的GANKYRIN是一個新的癌基因，最早在肝癌組織發(fā)現(xiàn)。GANKYRIN編碼的蛋白含有226個氨基酸，由7個錨蛋白ANKYRIN重復(fù)序列組成，在結(jié)構(gòu)上高度保守，分子量約為25KDA。研究表明，肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織QBGANKYRIN蛋白高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，顯示GANKYRIN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。盡管GANKYRIN在不少惡性腫瘤中高表達(dá)，然而現(xiàn)有的研究大部分集中在GANKYRIN與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥等方面，在胃癌等其它腫瘤的研究還不夠深入，沒有形成體系，缺少GANKYRIN與胃癌、頭頸部腫瘤、肺癌、大腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤關(guān)系的研究。所以，本實驗擬深入探討GANKYRIN對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和化療敏感性的影響及作用機(jī)制，對胃癌的預(yù)防、診斷、預(yù)后判斷及尋找新的藥物靶點都具有重要意義。材料與方法1、采用WESTERNBLOT法和免疫組織化學(xué)檢測胃癌和癌旁正常組織GANKYRIN的表達(dá)，同時評價GANKYRIN與臨床特征的關(guān)系。2、RTPCR和WESTERNBLOT檢測4種胃癌細(xì)胞系SGC．7901、MGC．803、BGC．823、HGC．27QBGANKYRIN的蛋白及MRN表達(dá)水平。3、使用脂質(zhì)體法將GANKYRIN的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入BGC．823細(xì)胞，將GANKYRIN特異SIRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胃癌HGC．27細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。4、通過流式細(xì)胞術(shù)、MTT實驗、軟瓊脂集落形成實驗等方法觀察GANKYRIN在胃癌細(xì)胞系增殖中的作用。5、裸鼠皮下成瘤實驗評估GANKYRIN表達(dá)改變后，對胃癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力及移植瘤生長的影響。6、WESTERNBLOT及RTPCR檢澳LJGANKYRIN上調(diào)、下調(diào)表達(dá)后胃癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子CYCLINDL、CYCLINE、PCNA、RB、P53和P27MRNA及蛋白表達(dá)的變化；WESTERNBLOT檢測上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中P13LM～KT通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況P13K、AKT、磷酸化P13K和磷酸化AKT。7、MTT法檢澳LGANKYRIN與胃癌細(xì)胞化療藥物敏感性的關(guān)系，HOECHST及AV／PI法檢測細(xì)胞凋亡，WESTERNBLOT檢測凋亡蛋白CASPASE3和CAPASE9的表達(dá)情況。實驗結(jié)果1、GANKYRIN在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中存在不同程度的表達(dá)。GANKYRIN在胃癌組織的陽性表達(dá)率100．00％78／78，明顯高于癌旁正常組織【癌旁正常組織的陽性表達(dá)率為62．82％49／78，P0．OI。各胃癌細(xì)胞系SGC．7901、MGC．803、BGC一823和HGC．27均有表達(dá)GANKYRIN，其中HGC．27表達(dá)水平最高，III

簡介：目錄?IVABSTRACT?V弓丨言???第一部分文獻(xiàn)綜述?2第1章白細(xì)胞介素8IL8的研究進(jìn)展?311ILB的生理生化特征?312IL8的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控?413IL8的受體?414IL8的生物學(xué)活性?4141?IL8對中性粒細(xì)胞的作用?4142?IL8對淋巴細(xì)胞的作用?4143?IL8對堿性粒細(xì)胞的作用?4144?IL8在血管發(fā)生中作用?415IL8在腫瘤發(fā)生中的作用?5151?IL8在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制?‘?5152?IL8在腫瘤血管生成中的作用?5153?IL8與其它因子在腫瘤進(jìn)展中的相互作用?616展望和結(jié)論?6第2章R干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶（GILT的研究進(jìn)展?721?GILT的活性特征?722?GILT的表達(dá)分布?723GIUT與相關(guān)疾病?724國內(nèi)外研究概況、水平和發(fā)展趨勢?7第3章研究物種介簡?931非洲爪蟾簡介???9311非洲爪蟾的分類及形態(tài)特征?9312非洲爪蟾的生活習(xí)性及分布?9313非洲爪蟾的研究用途?932非洲爪蟾的研究進(jìn)展?9321在疾病動物模型中的研究及應(yīng)用?10322在藥物篩選方面的研究及應(yīng)用?10I53實驗結(jié)果與分析?35531非洲爪蟾GILT基因的克隆與鑒定?36532氨基酸序列的同源比對及系統(tǒng)發(fā)生分析?37533?XLGILTMRNA組織分布研究?38534?XLSGILT蛋白的表達(dá)與純化?39535?XLSGILT蛋白的巰基還原酶活性?4054艦?49參考文獻(xiàn)?42附錄碩士在讀期間研究成果?48EILT?49IN

簡介：密級密級博士學(xué)位論文NUPR1NUPR1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、生物學(xué)功在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、生物學(xué)功能及分子機(jī)制研究能及分子機(jī)制研究作者姓名作者姓名李俊李俊指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師徐英輝徐英輝學(xué)科專業(yè)學(xué)科專業(yè)外科學(xué)外科學(xué)大連醫(yī)科大學(xué)大連醫(yī)科大學(xué)碩（博）士學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在指導(dǎo)教師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得大連醫(yī)科大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名簽字日期年月日

簡介：華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文山麥冬的細(xì)胞生物學(xué)與組織培養(yǎng)研究姓名周健丘申請學(xué)位級別碩士專業(yè)生藥學(xué)指導(dǎo)教師陳家春20090501華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2ABSTRACTLIRIOPESPICATATHUNBLOURISTHEIGINALVARIETYOFLIRIOPESPICATATHUNBLOURVARPROLIFERAYTMAWHICHISKNOWNASTHEMAINMATERIAMEDICAOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEMAIDONGLSPICATAVARPROLIFERAISAAUTHENTICMATERIAMEDICAINHUBEIPROVINCEWITHTHEAIMTOCOPEWITHRESEARCHOFSTERILITYOFLSPICATAVARPROLIFERATHEPRESENTSTUDYWASCARRIEDONLSPICATAINGEICSCYTOLOGYTISSUECULTUREHOPINGTOACQUIRESOMENOVELFINDINGSBETWEENTHETWOPLANTSTHERESULTSARESHOWNASFOLLOWS1KARYOTYPEOFLSPICATAWASEXAMINEDUSINGTHESQUASHMETHODWALLDEGRADATIONHYPOTONICTREATMENTWDHMETHODTHERESULTSINDICATEDTHATSQUASHMETHODWASABETTERWAYFLSPICATA’SKARYOTYPEANALYSISITISTETRAPLOIDTHEKARYOTYPEFMULAWHICHBELONGSTOSYMMETRICAL2BTYPEIS2N4X7248M24SM2MEIOTICBEHAVIPOLLENDEVELOPMENTOFLSPICATAWEREOBSERVEDUSINGTHESQUASHMETHODWDHMETHODPOLLENVIABILITYABERRATIONRATEWEREESTIMATEDDURINGTHEMEIOSISOFMICROSPEMOTHERCELLSMMCMOSTOFTHECELLSDISPLAYEDNMALLYWHILESOMECHROMOSOMEBRIDGESFRAGMENTSLAGGINGONESWEREFMEDATANAPHASE5POLLENABERRATIONRATEWAS344IN1106CELLS3ANTHERPOLLENDEVELOPMENTPROCESSOFLSPICATAWEREOBSERVEDUNDERMICROSCOPEBYMEANSOFPARAFFINSECTIONTHETAPETUMSHOWEDTHEACTERISTICSOFSECRETYTAPETUMWHICHBEGANTODEGRADEDURINGDYADSTAGETHETAPETUMDLELAYERCOMPLETELYDISAPPEAREDWHENPOLLENSWEREFULLYMATUREAT3CELLEDSTAGETAPETUMPLAYEDANIMPTANTROLEINANTHERPOLLENDEVELOPMENT4THISSTUDYSETUPANEWWAYFANTHERCULTUREINTERMEDIATEPROPAGATIONOFLSPICATACALLUSWASINDUCEDFROMANTHEROFLSPICATAONAMSMEDIUMSUPPLEMENTEDWITHDIFFERENTHMONESMSKT20MGL24D10MGLGAVETHEHIGHESTINDUCTIONRATIOWHICHWAS3077MS6BA1520MGLNAA0103MGLWASSUITABLEFTHEINDUCTIONPROLIFERATIONOFINDEFINITEBUDSTHEBUDSWERETRANSFERREDTO12MSMEDIUMSUPPLEMENTEDWITHNAA0103MGLFROOTINGTHESHOOTSPRODUCEDROOTSOFPDFCREATEDWITHPDFFACTYPROTRIALVERSION

簡介：間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS是干細(xì)胞家族中具有多向分化潛能以及自我更新能力的成體干細(xì)胞。自2002年WOODBURY等人首次報道將骨髓MSCS體外誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元以來，目前體外誘導(dǎo)MSCS分化成神經(jīng)元細(xì)胞有4種方法抗氧化劑誘導(dǎo)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)、中藥誘導(dǎo)以及基因編輯誘導(dǎo)。如何使MSCS分化而來的類神經(jīng)元細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的特性，是我們探究的方向。Ω3及Ω6族多不飽和脂肪酸POLYUNSATURATEDFATTYACID，PUFA及其代謝產(chǎn)物與細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)，它們可以通過多種作用機(jī)制，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖與分化，繼而影響干細(xì)胞的命運。我們的實驗在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLS，HUCMSCS神經(jīng)分化培養(yǎng)體系中增補PUFA，包括二十碳五烯酸EICOSAPENTAENOICACID，EPA及二十二碳五烯酸DOCOSAPENTENOICACID，DPA，MTSASSAY以及TRANSWELL遷移實驗結(jié)果表明，EPA和DPA可以促進(jìn)HUCMSCS的增殖、遷移而QRTPCR以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測表明，增補EPA和DPA后HUCMSCS分化的類神經(jīng)元細(xì)胞中多種神經(jīng)元特異性標(biāo)記的表達(dá)高于未增補PUFA的對照組，包括膠質(zhì)纖維酸性蛋白GLIALFIBRILLARYACIDICPROTEIN，GFAP、神經(jīng)絲蛋白NEUROFILAMENT，NF、酪氨酸羥化酶TYROSINEHYDROXYLASE，TH、神經(jīng)元核抗原NEURONALNUCLEARANTIGEN，NEUN、神經(jīng)元特異性稀醇化酶NEURONSPECIFICENOLASE，NES以及微管結(jié)合蛋白2MICROTUBULEASSOCIATEDPROTEIN2，MAP2等。這一結(jié)果顯示EPA和DPA參與HUCMSCS增殖、遷移及神經(jīng)分化。本實驗的研究成果有望用于細(xì)胞替代治療中，多不飽和脂肪酸增補培養(yǎng)HUCMSCS后，分化成可行使功能的神經(jīng)細(xì)胞，替代引起病變的已壞死的神經(jīng)細(xì)胞，以達(dá)到減緩或治愈神經(jīng)退行性疾病的目的。

簡介：目的通過研究OX40和OX40L分子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE患者外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá)及其在SLE發(fā)病機(jī)制中的可能作用，調(diào)控OX40、OX40L在相應(yīng)靶細(xì)胞上的表達(dá)和阻斷OX40OX40L通路從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，為治療自身免疫疾病提供新的思路。方法采用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)對43例SLE患者和15例健康志愿者外周血淋巴細(xì)胞上OX40和OX40L的表達(dá)水平進(jìn)行分析，同時，對SLE患者中的腎炎型與非腎炎型外周血淋巴細(xì)胞上OX40和OX40L的表達(dá)水平進(jìn)行比較，并對10例SLE患者進(jìn)行治療前后OX40和OX40L表達(dá)水平的比較。測定OX40和OX40L表達(dá)水平的具體步驟為1每個流式管加入50UL外周血，分別加入CD4TC、OX40FITC和OX40LPE，4℃度反應(yīng)時間20MIN；2同時設(shè)陰性對照管，對照管中加入CD4TC、IGGFITC和IGGPE或CD19FITC、IGGPE，4度反應(yīng)20MIN；3加入溶血劑裂解紅細(xì)胞直至液體變清；4再加磷酸鹽緩沖液PBS洗滌；5離心1800RPM，5MIN；6離心后，倒掉上清，加05MLPBS上流式細(xì)胞儀測表型。結(jié)果OX40和OX40L在CD4T細(xì)胞上共表達(dá)。與正常對照組相比1SLE患者外周血中，CD4TOX40OX40L細(xì)胞亞群數(shù)量增加；2CD8TOX40OX40L細(xì)胞亞群數(shù)量無變化；3OX40LB細(xì)胞增加；4OX40L單核細(xì)胞增加；5OX40L在NK細(xì)胞上表達(dá)增強。在SLE患者中，腎炎型患者CD4OX40T細(xì)胞增加且明顯大于非腎炎型；此外，發(fā)現(xiàn)SLE患者治療后OX40和OX40L表達(dá)均有不同程度下調(diào)。結(jié)論SLE患者外周血T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞上存在OX40和OX40L的異常表達(dá)，在腎炎型患者表達(dá)上調(diào)，治療前后表達(dá)水平有顯著變化。提示OX40OX40L信號在T細(xì)胞與單核細(xì)胞、NK細(xì)胞的相互作用過程中可能有助于T細(xì)胞的持續(xù)活化，從而參與SLE的發(fā)生發(fā)展。

簡介：VERO細(xì)胞是WHO和我國生物制品規(guī)程認(rèn)可使用的人用疫苗生產(chǎn)細(xì)胞系。VERO細(xì)胞廣泛的病毒感染譜、高效的病毒擴(kuò)殖效率、無致瘤性和便于迅速擴(kuò)大培養(yǎng)等優(yōu)勢使其成為目前世界人用疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞株之一。但是，VERO細(xì)胞自身高度的貼壁性和對血清的依賴以及在生物反應(yīng)器中的大量凋亡等缺陷也嚴(yán)重制約著現(xiàn)行的疫苗生產(chǎn)工藝。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HUMANTELOMERASEREVERSETRANASE，HTERT被認(rèn)為是端粒酶的重要組成部分和限速因子。越來越多的證據(jù)顯示，HTERT除參與形成端粒酶復(fù)合物、延長端粒長度和保證細(xì)胞分裂過程中的基因組穩(wěn)定性之外，可以有效減少惡劣培養(yǎng)環(huán)境帶來的細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的生存能力。組成型過量表達(dá)HTERT是值得關(guān)注和探索的改善細(xì)胞培養(yǎng)特性、提高哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)量的有效技術(shù)途徑。本課題的研究目標(biāo)是建立能夠穩(wěn)定高水平表達(dá)HTERT的VERO細(xì)胞系，考察過表達(dá)HTERT及不同的HTERT表達(dá)水平對VERO細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性帶來的影響。以EGFP為報告基因，借助流式細(xì)胞分析驗證了真核表達(dá)載體PHEFCHMARHYG在VERO細(xì)胞的表達(dá)效果，構(gòu)建了HTERT高效表達(dá)載體PHEFCHMARHYGHTERT。采用RTPCR和REALTIMEPCR分析PHEFCHMARHYGHTERT轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞克隆HTERTMRNA的表達(dá)水平，從中選取HTERTMRNA相對表達(dá)水平是野生型VERO細(xì)胞的3526倍和614倍的HTERT組成型過量表達(dá)VERO細(xì)胞系，T1和T3。采用WESTERNBLOT分析和TRAPPCR的方法驗證了HTERTMRNA、蛋白水平和功能表達(dá)的一致性及T1、T3細(xì)胞組成型過量表達(dá)HTERT的穩(wěn)定性。以活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力為主要觀察指標(biāo)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和貼附伸展動態(tài)，考察HTERT組成型過量表達(dá)VERO細(xì)胞T1和T3在靜止貼附培養(yǎng)、微載體固定化培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)體系中的細(xì)胞生長。HTERT的組成型過量表達(dá)在降低VERO細(xì)胞的貼附伸展能力的同時，賦予了T1和T3細(xì)胞，尤其是T1細(xì)胞非貼附依賴性生長的能力。同時，HTERT的組成型過量表達(dá)降低了VERO細(xì)胞體外培養(yǎng)對血清的依賴程度，提高了細(xì)胞批次培養(yǎng)后期的細(xì)胞活力和活細(xì)胞密度。以葡萄糖比消耗速率QGLU、乳酸比生成速率QLAC、乳酸轉(zhuǎn)化率YLACGLU和谷氨酰胺比消耗率QGLN為反映細(xì)胞代謝的主要觀察指標(biāo)，考察T1、T3細(xì)胞和野生型VERO細(xì)胞在靜止貼附培養(yǎng)、微載體固定化培養(yǎng)的細(xì)胞代謝。T1、T3細(xì)胞在不同的培養(yǎng)體系中均表現(xiàn)為與野生型VERO細(xì)胞基本相同的葡萄糖、乳酸和氨基酸代謝特征。表明HTERT的組成型過量表達(dá)可能不對VERO細(xì)胞的代謝產(chǎn)生明顯的影響。研究結(jié)果表明HTERT的組成型過量表達(dá)降低了VERO細(xì)胞貼附生長依賴性和對血清的依賴程度，有利于在細(xì)胞培養(yǎng)后期細(xì)胞活力的維持和活細(xì)胞密度的提高，是有應(yīng)用潛力的改良哺乳動物細(xì)胞體外培養(yǎng)性狀的技術(shù)途徑。

簡介：分類號R737UDC密級重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目RONRON在膀胱癌組織中的表達(dá)及對在膀胱癌組織中的表達(dá)及對T24T24細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)行為行為的影響的影響作者姓名張莎莎張莎莎申請學(xué)位級別碩士學(xué)科、專業(yè)名稱全科醫(yī)學(xué)全科醫(yī)學(xué)論文答辯年月2016年5月2016年5月指導(dǎo)教師姓名（職稱、單位名稱）張翾副教授副教授重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院目錄英漢縮略語名詞對照英漢縮略語名詞對照1中文摘要中文摘要3英文摘要英文摘要4RON在膀胱癌組織中的表達(dá)及對在膀胱癌組織中的表達(dá)及對T24細(xì)胞生物學(xué)行為細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的影響6前言61材料72方法83結(jié)果164討論19全文總結(jié)全文總結(jié)21文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述22參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)28致謝37攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文38

簡介：在病毒性疫苗的研究開發(fā)工作中，人二倍體細(xì)胞作為病毒抗原的制備基質(zhì)是整個疫苗研發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)量控制的首要選擇。對作為疫苗制備基質(zhì)的人二倍體細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性及其病毒感染生物學(xué)反應(yīng)特征的相關(guān)分析，將為病毒疫苗的研究及開發(fā)包括疫苗安全性的研究提供更為豐富的資料。從細(xì)胞生物學(xué)的角度看，細(xì)胞特定酶學(xué)反應(yīng)特征被認(rèn)為可以反映細(xì)胞的遺傳學(xué)特性和生物學(xué)性狀?，F(xiàn)有的資料表明，當(dāng)細(xì)胞面臨病毒感染時，其具有天然免疫反應(yīng)性質(zhì)的生物學(xué)反應(yīng)事實上是與其自身的生物學(xué)性狀相關(guān)的。其中細(xì)胞所產(chǎn)生的干擾素反應(yīng)，在病毒疫苗制備技術(shù)工藝上又是一個具有重要意義的質(zhì)量指標(biāo)，而該指標(biāo)與細(xì)胞增殖過程中的生物學(xué)活性狀態(tài)具有直接的相互聯(lián)系。因此，分析細(xì)胞酶活性特征與其在病毒感染時的干擾素反應(yīng)強度，顯然對這類細(xì)胞用于疫苗制備時的技術(shù)研究具有重要的意義。因此本文采用多種細(xì)胞系，多代細(xì)胞，通過生化方法檢測細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力變化以鑒定細(xì)胞的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，人胚肺二倍體細(xì)胞（KMB17細(xì)胞）和新型的人胚肺二倍體細(xì)胞（N0細(xì)胞）在細(xì)胞代次超過30代后，細(xì)胞內(nèi)的酶活力會發(fā)生一定的變化，乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力上升，超氧化物歧化酶的酶活力下降，表明這兩種細(xì)胞在細(xì)胞代次超過30代后，細(xì)胞的增殖、代謝等能力會下降，細(xì)胞穩(wěn)定性較差，不利于用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。VERO細(xì)胞和HELA細(xì)胞隨著細(xì)胞代次增加酶活力無明顯變化，表明這兩種細(xì)胞在實驗所采用的細(xì)胞代次內(nèi)，細(xì)胞的增殖、代謝等能力基本保持穩(wěn)定。本文重點分析了各種酶活性指標(biāo)的變化與細(xì)胞在RNA病毒和DNA病毒感染時所產(chǎn)生的干擾素反應(yīng)的相互聯(lián)系，以及這些相互聯(lián)系所導(dǎo)致的病毒感染滴度的變化情況。做為在細(xì)胞核內(nèi)完成增殖和在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成增殖的HSV1病毒和EV71病毒感染人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17、N0時，其引起IFNΑ的相對表達(dá)量與細(xì)胞的酶活力、細(xì)胞的生長狀態(tài)有很大的關(guān)系。當(dāng)人胚肺二倍體細(xì)胞培養(yǎng)到第3天時，細(xì)胞酶活力處于上升階段，細(xì)胞的生長狀態(tài)較好，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第5天時，細(xì)胞酶活力處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞的生長狀態(tài)也維持相對穩(wěn)定，兩種病毒感染培養(yǎng)到第5天細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量比感染培養(yǎng)到第3天細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量高，而病毒滴度在感染過程中逐漸上升，但隨著干擾素分泌的增加而其增殖逐漸變低的事實，提示了人二倍體細(xì)胞在病毒增殖過程中所具有的容納限度，可能與干擾素的產(chǎn)生濃度相關(guān)。當(dāng)兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天和第5天的HELA細(xì)胞時，其引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量與細(xì)胞的酶活力關(guān)系不大，且比感染其他種類細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量低，這提示了該細(xì)胞作為一種腫瘤細(xì)胞的非限制型特征。反之，兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天的VERO細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量比感染培養(yǎng)到第5天細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量高，且病毒滴度前者也高于后者。這一特征有別于人二倍體細(xì)胞，似乎提示了VERO細(xì)胞的生物學(xué)特性，這些通過研究病毒感染后引起細(xì)胞分泌的IFNΑ相對表達(dá)量的變化與細(xì)胞酶活力、細(xì)胞生長狀態(tài)之間的關(guān)系的工作，雖然這需要進(jìn)一步的確證和分析，但相關(guān)的數(shù)據(jù)將又為疫苗的研究和制備提供相應(yīng)的實驗依據(jù)。

簡介：目的我們描述并且比較兩種不同方法獲得微血管內(nèi)皮細(xì)胞BRAINMICROVULARENDOTHELIALCELLS，BMECS的方法其目的是為了展現(xiàn)出不同方法獲得微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，以及探討這兩種方法在細(xì)胞生成上是否存在不同。材料和方法一、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代提取和培養(yǎng)一種方法用機(jī)械和酶分解的方法處理腦組織，主要涉及密度離心和免疫磁珠純化等步驟，另一種方法包括機(jī)械分離，兩次酶消化，20％BSA和PERCOLL離心，加入完全培養(yǎng)基高糖DMEM、20％PDS、4UGML嘌呤霉素（僅應(yīng)用2天）、100UGML肝素、4NGMLBFGF、10UGML內(nèi)皮細(xì)胞生長支持物、2MML一谷氨酰胺、100UML青霉素、100UGML鏈霉素以及025UGML兩性霉素B。12小時后首次換液以去除未貼壁的細(xì)胞及血管段放入37℃，5％CO2孵箱，每隔兩天換液一次。二、蛋白免疫印跡分析用刮刀將BMECS混成，溶于勻漿，溶于PBS以1000R離心5MIN。棄上清后加入裂解液，細(xì)胞溶液放置于冰上10MIN，震蕩1MIN后，15000G離心5MIN。收集上清，采用BCA試劑盒測試濃度。上樣后，跑膠，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2小時。TBST洗膜3次10MIN次，一抗孵育過夜，第二天辣根過氧化物酶孵育后上機(jī)發(fā)光。三、免疫熒光當(dāng)BMECS長滿后，去除培養(yǎng)基，溶于1XPBS沖洗3次。預(yù)冷100％乙醇被用作兔抗大鼠血管第八因子抗體固定30分鐘，4％多聚甲醛用于固定兔抗大鼠CLAUDIN5固定劑，室溫下固定30MIN。PBS沖洗3次后，01％TRITONX100細(xì)胞膜打孔5MIN，PBS清洗后加入5％BSA室溫封閉30MIN。一抗用1％BSA封閉后在4℃下孵育過夜。熒光二抗（FITC異硫氰酸熒光素山羊抗兔IGG，TRITC四乙基若丹明異硫氰酸鹽山羊抗兔IGG）用1％BSA包含DAPI苯基吲哚藍(lán)色熒光5ΜGML稀釋并且樣品在37℃避光孵育半小時。四、體外血腦屏障的建立及通透性通過MILLICELLERS（電阻系統(tǒng)）得到的3天的初級電鍍來評估TEER。當(dāng)BMECS聚集時，1ΜM熒光素鈉的DMEM加入到TRANSWELL系統(tǒng)的上面。計根據(jù)下層小室熒光鈉的吸光度，計算出單層BMECS的通透性。五、細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定將細(xì)胞放入有含有FLUO3AM10ΜMOLML的DMEM中避光30分鐘，孵育后用ACSF沖洗掉過多的FLUO3AM。BK刺激后細(xì)胞內(nèi)CA2變化采用在共聚焦顯微鏡下在激發(fā)波長為488NM，發(fā)射波長為505NM的數(shù)值下進(jìn)行測量，F(xiàn)0為細(xì)胞靜息狀態(tài)下的熒光變化，△F為變化后的數(shù)值與靜息狀態(tài)下的數(shù)值的比值，整個細(xì)胞的鈣離子變化為％△FF0。結(jié)果最終的的細(xì)胞通過內(nèi)皮的特殊抗原VONWILLEBRFACT和CLAUDINE5，跨內(nèi)皮電阻TRANSENDOTHELIALELECTRICALRESISTANCE，TEER，熒光蛋白滲透性和細(xì)胞內(nèi)CA2變化的測量來測定鑒定。最后我們從原代細(xì)胞中獲得了兩種生物學(xué)特性的細(xì)胞并且經(jīng)過鑒定均為微血管內(nèi)皮細(xì)胞，這兩種內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)特性、跨內(nèi)皮電阻、應(yīng)用緩激肽后的反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用均有所差異。結(jié)論緩激肽105M觸發(fā)原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子波，細(xì)胞外鈣離子是鈣離子峰的前提和必要條件此鈣離子波屬于鈣觸發(fā)鈣離子釋放機(jī)制。我們也發(fā)現(xiàn)兩種方法獲得的BEMCS在細(xì)胞形態(tài)、TEER、和應(yīng)用BK后的反應(yīng)上存在不同，可能是由于細(xì)胞的異質(zhì)性。

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簡介：目的鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMMSC；通過檢測仿生脈沖電磁場BPEMF對BMMSC成骨、成脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)影響，研究其促進(jìn)成骨及抑制成脂肪分化的效應(yīng)；在對BMMSC施加電磁場的基礎(chǔ)上加用鈣通道阻滯劑維拉帕米，檢測胞內(nèi)CAMP水平的變化，探討第二信使對BMMSC的生物學(xué)特性的影響，并初步探討其機(jī)制。方法選擇體重為80120G的WISTAR大鼠，雌雄不限，應(yīng)用密度梯度離心貼壁篩選法提取BMMSC，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第三代，用于實驗。實驗分為三組，空白對照組A、BPEMF組B、BPEMF維拉帕米組C。應(yīng)用MTT測定BPEMF刺激早期39D及后期1115D細(xì)胞增殖情況；應(yīng)用REALTIMEPCR方法測定BMMSC成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵基因核心結(jié)合因子RUNX2的表達(dá)；應(yīng)用RTPCR測定BMMSC成脂肪分化基因過氧化物酶增殖因子激活物受體ΓPPARΓ及調(diào)節(jié)成骨破骨平衡相關(guān)基因骨保護(hù)蛋白OPG及核因子KB受體活化因子配基RANKLE的表達(dá)；應(yīng)用ELISA測定BMMSC胞內(nèi)CAMP、堿性磷酸酶ALP水平的變化。結(jié)果提取的細(xì)胞呈梭形或多角形，折光性良好。在成骨誘導(dǎo)三周后茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成，成脂肪誘導(dǎo)兩周后油紅O染色可見多量脂滴形成，符合BMMSC多向分化的特性；MTT結(jié)果顯示BPEMFB組相比空白對照A組對BMMSC在早期有促進(jìn)增殖的作用，在晚期促進(jìn)增殖的作用減弱，BPEMF維拉帕米組C組一定程度上抑制細(xì)胞增殖；REALTIMEPCR顯示B、C組比A組成骨分化關(guān)鍵基因RUNX2表達(dá)明顯上調(diào)；RTPCR顯示B、C組比A組成脂肪分化相關(guān)基因PPARΓ2表達(dá)下調(diào)，骨保護(hù)素基因表達(dá)明顯上調(diào)，RANKL基因表達(dá)影響并不明顯；ELISA顯示ALP、CAMP表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論BPEMF對BMMSC在刺激早期有促進(jìn)增殖的作用，這種作用是CA2升高的結(jié)果并會隨著刺激的進(jìn)行而減弱；BEMF會刺激CAMP升高，CAMP起到抑制干細(xì)胞增殖并促進(jìn)成骨分化的作用。BPEMF可以促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)，抑制促成脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化及抑制成脂肪分化；可以促進(jìn)OPG表達(dá)，提高OPGRANKL比值，從而可能通過基因表達(dá)對細(xì)胞周圍微環(huán)境成骨破骨平衡起到調(diào)節(jié)作用。

簡介：目的白血病是起源于造血干祖細(xì)胞的一組惡性疾病，在發(fā)病機(jī)制以及臨床表現(xiàn)方面具有較大的異質(zhì)性，近年來，該病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。目前，白血病在診斷及治療方面取得了較大的進(jìn)展，以化療為基礎(chǔ)的綜合性治療，尤其是異基因造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展大大的改善了患者的生存。對白血病發(fā)病機(jī)制的深入研究推動了該病的診治進(jìn)展，慢性粒細(xì)胞白血病及急性早幼粒細(xì)胞白血病患者受益于靶向藥物的出現(xiàn)，可以長期無病生存。但是除上述兩種類型外，其他類型白血病的治療效果仍不能令人滿意。因此，對白血病發(fā)病機(jī)制的深入探討有助于全面了解白血病的發(fā)生及發(fā)展，并為白血病的靶向治療提供潛在的可能。DACT1是DAPPER家族成員之一，可以通過降解WNT通路的關(guān)鍵因子散亂蛋白調(diào)節(jié)經(jīng)典WNTΒCATENIN信號通路。研究證實DACT1在肝癌、乳腺癌及胃癌等腫瘤細(xì)胞中具有抑癌基因的作用，但在結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。DACT1在髓系白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況及作用尚不明確，其對白血病細(xì)胞的增殖及凋亡起到何種作用，作用途徑與其在實體腫瘤中有無異同，都是我們需要探討及解決的問題。為了揭示DACT1在髓系白血病中的作用及機(jī)制，我們進(jìn)行了一系列研究，希望能為白血病的診治提供新的思路。方法采集急性髓系白血病患者骨髓液，通過密度梯度離心法提取單個核細(xì)胞，應(yīng)用實時熒光定量PCR法測定樣本DACT1的MRNA表達(dá)情況，并以非惡性血液病患者骨髓標(biāo)本為正常對照。同時以髓系白血病細(xì)胞系K562、HL60、KG1Α、THP1及NB4為研究對象，檢測DACT1MRNA的表達(dá)篩選出低表達(dá)DACT1的K562及KG1Α細(xì)胞應(yīng)用ATTRACTENETRANSFECTIONREAGENT轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，通過實時熒光定量PCR和WESTERNBLOT法驗證轉(zhuǎn)染效果采用免疫熒光法檢測DACT1在細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位利用CCK8法檢測DACT1對K562及KG1Α細(xì)胞增殖活性的影響采用克隆形成實驗檢測過表達(dá)DACT1對K562及KG1Α細(xì)胞克隆形成能力的影響應(yīng)用ANNEXINⅤFITCPI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1對K562及KG1Α細(xì)胞周期分布的影響為了探討過表達(dá)DACT1對凋亡相關(guān)蛋白的影響，我們應(yīng)用WESTERNBLOT方法檢測BCL2，BAX，CASPASE3和CASPASE9蛋白的表達(dá)情況為了探討DACT1作用于髓系白血病細(xì)胞的具體機(jī)制，我們應(yīng)用實時熒光定量PCR法測定WNT通路關(guān)鍵因子ΒCATENIN的MRNA表達(dá)應(yīng)用免疫熒光法檢測ΒCATENIN蛋白的亞細(xì)胞定位采用WESTERNBLOT法檢測WNT通路靶蛋白的表達(dá)。我們進(jìn)一步利用CCK8法檢測過表達(dá)DACT1對白血病細(xì)胞化療敏感性的影響應(yīng)用WESTERNBLOT法檢測過表達(dá)DACT1對多藥耐藥蛋白BCRP及PGP的影響為了研究DACT1是否影響藥物外排，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1對KG1Α細(xì)胞中羅丹明濃度的影響。結(jié)果⑴DACT1在急性髓系白血病患者中的MRNA表達(dá)水平明顯低于非惡性血液病者。應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測髓系白血病細(xì)胞系K562、HL60、KG1Α、THP1及NB4細(xì)胞DACT1MRNA的表達(dá)，可見DACT1在髓系白血病細(xì)胞中普遍存在低表達(dá)。轉(zhuǎn)染DACT1質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒VECT進(jìn)入K562及KG1Α細(xì)胞，應(yīng)用實時熒光定量PCR和WESTERNBLOT法證實了轉(zhuǎn)染后DACT1在K562及KG1Α細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。免疫熒光結(jié)果顯示DACT1主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，轉(zhuǎn)染后可以增加DACT1在細(xì)胞漿中的表達(dá)。應(yīng)用CCK8法檢測DACT1對K562及KG1Α細(xì)胞增殖活性的影響，與K562及K562VECT相比，K562DACT1細(xì)胞增殖速度明顯減慢與KG1Α及KG1ΑVECT相比，KG1ΑDACT1細(xì)胞增殖速度明顯減慢。DACT1過表達(dá)可以抑制K562及KG1Α細(xì)胞的增殖活性?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示過表達(dá)DACT1能明顯抑制細(xì)胞的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義轉(zhuǎn)染48H后應(yīng)用ANNEXINⅤFITCPI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示過表達(dá)DACT1可以誘導(dǎo)K562和KG1Α細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義采用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1對K562及KG1Α細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果可見G0G1期細(xì)胞比例較對照組明顯增高，而S期及G2M期比例降低，，過表達(dá)DACT1使K562及KG1Α細(xì)胞更多的停滯于G0G1期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。為了檢測過表達(dá)DACT1對凋亡相關(guān)蛋白的影響，我們應(yīng)用WESTERNBLOT方法檢測BCL2，BAX，CASPASE3和CASPASE9蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，過表達(dá)DACT1可以使促凋亡蛋白BAX、CASPASE3、CASPASE9表達(dá)升高，抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)下調(diào)。⑵利用實時熒光定量PCR法檢測過表達(dá)DACT1后WNTΒCATENIN通路中關(guān)鍵因子ΒCATENIN的MRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，DACT1過表達(dá)可以使KG1Α細(xì)胞中ΒCATENIN的MRNA表達(dá)下調(diào)采用間接免疫熒光法檢測DACT1過表達(dá)是否對ΒCATENIN蛋白的亞細(xì)胞定位產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示，DACT1過表達(dá)組細(xì)胞核中的熒光強度明顯低于對照組，表明過表達(dá)DACT1可能影響了ΒCATENIN在胞漿及胞核中的分布比例，使其在胞核中的量減少利用WESTERNBLOT方法檢測CYCLIND1、CMYC及IL8蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，DACT1過表達(dá)組CYCLIND1、CMYC及IL8蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。⑶利用CCK8法檢測過表達(dá)DACT1對柔紅霉素的化療敏感性，柔紅霉素終濃度為1UGML，孵育24H、48H、72H后進(jìn)行CCK8檢測。結(jié)果顯示，過表達(dá)DACT1可增加KG1Α細(xì)胞對柔紅霉素的細(xì)胞毒作用利用WESTERNBLOT法檢測多藥耐藥蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與陰性對照組及空白對照組相比，過表達(dá)DACT1組多藥耐藥蛋白BCRP、PGP的表達(dá)下調(diào)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DACT1組、空載體轉(zhuǎn)染組及空白對照組羅丹明的平均熒光強度，結(jié)果顯示，DACT1過表達(dá)組KG1Α細(xì)胞內(nèi)羅丹明的平均熒光強度明顯增加，表明過表達(dá)DACT1后細(xì)胞內(nèi)藥物濃度明顯增加。結(jié)論①同正常對照相比，DACT1在急性髓系白血病患者和白血病細(xì)胞系中的表達(dá)明顯下調(diào)。②過表達(dá)DACT1可以抑制白血病細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使白血病細(xì)胞更多的阻滯于G0G1期。③過表達(dá)DACT1通過抑制WNTΒCATENIN信號通路影響白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為。④過表達(dá)DACT1可以增加KG1A細(xì)胞對柔紅霉素的化療敏感性，并使多藥耐藥蛋白PGP及BCRP的表達(dá)減少。

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簡介：目的（1）在明確人轉(zhuǎn)化生長因子Β（HTGFΒ）誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCS）向骨組織細(xì)胞分化作用的基礎(chǔ)上，基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)BMSCS的HTGFΒ1基因修飾；（2）研究HTGFΒ1聯(lián)合HBMP2協(xié)同誘導(dǎo)BMSCS成骨作用的影響，闡明其成為理想骨組織工程種子細(xì)胞價值。方法1利用基因同源重組原理，通過ADMAX腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建HTGFΒ1重組腺病毒，以及對照組病毒PADMAXEGFP3FLAG。2目的基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立（1）采用差速貼壁傳代篩選法和流式細(xì)胞鑒定相結(jié)合，分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；（2）通過腺病毒載體介導(dǎo)HTGFΒ1基因轉(zhuǎn)染BMSCS，分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，確定最佳感染復(fù)數(shù)；（3）RTPCR檢測轉(zhuǎn)染后BMSCS中HTGFΒ1的表達(dá)情況；ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的表達(dá)。3雙基因修飾的BMSCS細(xì)胞生物學(xué)特性分析將外源基因修飾的BMSCS分為5組A正常MSCS組；B空病毒修飾組；CHBMP2修飾組；DHTGFΒ1修飾組；EHTGFΒ1HBMP2修飾組。（1）采用MTT法測定各組細(xì)胞增殖能力；（2）酶促反應(yīng)檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性。結(jié)果1成功將HTGFΒ1基因?qū)氡磉_(dá)載體PAVMCMVEGFP3FLAG中，構(gòu)建了重組腺病毒ADHTGFΒ1DNA測序證明，所克隆目的基因序列與GENEBANK收錄一致。（2）通過結(jié)合貼壁培養(yǎng)法和流式細(xì)胞鑒定高效、快速的分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過GFP熒光表達(dá)提示目的基因存在于所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；RTPCR顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有大量目的基因MRNA轉(zhuǎn)錄；ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿中有目的蛋白的表達(dá)。（3）不同基因修飾后的MSCS增殖能力均得到不同程度的增強，其中HTGFΒ1和HBMP2共同修飾對促進(jìn)MSCS的增殖能力最明顯；ELISA檢測顯示雙轉(zhuǎn)組中MSCS的ALP活性明顯高于各單轉(zhuǎn)組。結(jié)論（1）利用新的ADMAX腺病毒載體轉(zhuǎn)染方法可使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高效穩(wěn)定地表達(dá)HTGFΒ1及HBMP2基因；（2）利用兩種基因間的協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用HTGFΒ1和HBMP2可明顯促進(jìn)組織工程骨種子細(xì)胞的成骨化，效果優(yōu)于單用一種生長因子。