原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞異質(zhì)性和生物學特性初步研究.pdf

1、目的：
　　我們描述并且比較兩種不同方法獲得微血管內(nèi)皮細胞(brain micro-vascularendothelial cells，BMECs)的方法;其目的是為了展現(xiàn)出不同方法獲得微血管內(nèi)皮細胞的生物學特性，以及探討這兩種方法在細胞生成上是否存在不同。
　　材料和方法：
　　一、腦微血管內(nèi)皮細胞的原代提取和培養(yǎng)
　　一種方法用機械和酶分解的方法處理腦組織，主要涉及密度離心和免疫磁珠純化等步驟，另一種方法包括

2、機械分離，兩次酶消化，20％BSA和percoll離心，加入完全培養(yǎng)基:高糖DMEM、20％PDS、4ug/mL嘌呤霉素（僅應用2天）、100ug/mL肝素、4ng/mL bFGF、10ug/mL內(nèi)皮細胞生長支持物、2mM L一谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素以及0.25ug/mL兩性霉素B。12小時后首次換液以去除未貼壁的細胞及血管段;放入37℃，5％CO2孵箱，每隔兩天換液一次。
　　二、蛋白免疫印跡分析

3、
　　用刮刀將BMECs混成，溶于勻漿，溶于PBS以1000R離心5min。棄上清后加入裂解液，細胞溶液放置于冰上10min，震蕩1min后，15000g離心5min。收集上清，采用BCA試劑盒測試濃度。上樣后，跑膠，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2小時。 TBST洗膜3次(10min/次)，一抗孵育過夜，第二天辣根過氧化物酶孵育后上機發(fā)光。
　　三、免疫熒光
　　當BMECs長滿后，去除培養(yǎng)基，溶于1xPBS沖洗3次。預冷1

4、00％乙醇被用作兔抗大鼠血管第八因子抗體;固定30分鐘，4％多聚甲醛用于固定兔抗大鼠Claudin-5固定劑，室溫下固定30min。PBS沖洗3次后，0.1％Triton X-100細胞膜打孔5min，PBS清洗后加入5％BSA室溫封閉30min。一抗用1％BSA封閉后在4℃下孵育過夜。熒光二抗（FITC異硫氰酸熒光素山羊抗兔IgG，TRITC四乙基若丹明異硫氰酸鹽山羊抗兔IgG）用1％BSA(包含DAPI苯基吲哚/藍色熒光5μg/ml

5、)稀釋并且樣品在37℃避光孵育半小時。
　　四、體外血腦屏障的建立及通透性
　　通過Millicell-ERS（電阻系統(tǒng)）得到的3天的初級電鍍來評估TEER。當BMECs聚集時，1μM熒光素鈉的DMEM加入到Transwell系統(tǒng)的上面。計根據(jù)下層小室熒光鈉的吸光度，計算出單層BMECs的通透性。
　　五、細胞內(nèi)鈣離子測定
　　將細胞放入有含有Fluo-3/AM(10μmol/ml)的DMEM中避光30分鐘，孵育

6、后用ACSF沖洗掉過多的Fluo-3/AM。BK刺激后細胞內(nèi)Ca2+變化采用在共聚焦顯微鏡下在激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為505nm的數(shù)值下進行測量，F(xiàn)0為細胞靜息狀態(tài)下的熒光變化，△F為變化后的數(shù)值與靜息狀態(tài)下的數(shù)值的比值，整個細胞的鈣離子變化為％△F/F0。
　　結(jié)果：
　　最終的的細胞通過內(nèi)皮的特殊抗原(von willebrand fact和claudine-5)，跨內(nèi)皮電阻(trans-endothelial

7、electrical resistance，TEER)，熒光蛋白滲透性和細胞內(nèi)Ca2+變化的測量來測定鑒定。最后我們從原代細胞中獲得了兩種生物學特性的細胞并且經(jīng)過鑒定均為微血管內(nèi)皮細胞，這兩種內(nèi)皮細胞在形態(tài)學、生態(tài)學特性、跨內(nèi)皮電阻、應用緩激肽后的反應和內(nèi)皮細胞的屏障作用均有所差異。
　　結(jié)論：
　　緩激肽10-5M觸發(fā)原代腦微血管內(nèi)皮細胞鈣離子波，細胞外鈣離子是鈣離子峰的前提和必要條件:此鈣離子波屬于鈣觸發(fā)鈣離子釋放機制。