簡介：固定化細胞可以提高細胞在反應液中的集中度便于細胞與反應液的分離，并有效阻止惡劣條件如PH、溫度、有毒物質(zhì)對細胞的侵害，對催化細胞起到保護的作用。盡管如此，傳統(tǒng)固定化方法的固定化介質(zhì)提供的狹小空間和相對較差的傳質(zhì)和擴散性能阻礙了細胞的生長，且存在細胞泄露的缺陷。為了克服傳統(tǒng)固定化方法的缺陷，本文將微生物組織工程支架引入到固定化催化方面來。分別采用聚乙烯醇、海藻酸鈣作為支架材料，啤酒酵母為種子細胞，用聚乙烯醇有機蒙脫石納米復合凝膠分別對兩種支架進行包衣，制備兩種不同的微生物組織工程支架。分別考察并比較兩種支架的特性以及這兩種包衣片的性質(zhì)，同時利用制備好的微生物組織工程包衣片進行簡單的乙醇催化，考察其儲存穩(wěn)定性及重復利用能力。首先，以聚乙烯醇蒙脫石復合物為支架材料，制備出直徑為4MM、厚度為2MM的片狀多孔支架。采用鹽浸法制孔，通過調(diào)節(jié)聚乙烯醇、蒙脫石的混合溶液與致孔劑的配比及優(yōu)化，對模型反復凍融得孔隙率為71％的三維多孔支架。以海藻酸蒙脫石復合物為支架材料，制備出直徑為8MM、厚度為2MM的碟狀多孔支架。采用石蠟微球浸出法，通過調(diào)節(jié)海藻酸鈉、蒙脫石的混合溶液與致孔劑的配比及優(yōu)化。使用氯化鈣的溶液與其進行離子交換，經(jīng)干燥、石蠟浸出得孔隙率為93％的三維多孔支架。前者水溶液中無膨脹現(xiàn)象，后者膨脹系數(shù)為118兩種支架操作都較簡單，對酵母細胞毒性小，皆適合用于酵母細胞培養(yǎng)。對兩種支架進行擴散分析，皆得到較好效果。其次，以兩種三維支架作為載體，用以接種啤酒酵母細胞進行培養(yǎng)，以聚乙烯醇有機蒙脫石納米復合凝膠對生長了細胞的三維支架進行包衣，并經(jīng)過硼酸交聯(lián)和硫酸鈉硬化，得到微生物組織工程包衣片。考察兩種支架的細胞載量、包衣效果，以及作為生物催化劑在不同PH和溫度下兩種包衣片細胞醇脫氫酶ALCOHOLDEHYDROGENASE，ADH的活性影響、凝膠包衣片細胞的儲藏穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，聚乙烯醇支架細胞載量為32MGCELLDWCM3GEL，海藻酸支架細胞載量為45MGCELLDWCM3GEL。兩種支架的包衣厚度為200～300ΜM，無細胞泄露現(xiàn)象。無論是PH還是溫度，相對于游離細胞包衣片內(nèi)細胞的耐受能力都得到明顯提高。在4℃儲藏一個月后，包衣片內(nèi)細胞的ADH酶的活性還保留了其最初活性的754％。最后，以PVAMMT微生物組織工程包衣片作為生物催化劑用來生物催化生產(chǎn)乙醇。對每次催化后的支架進行再培養(yǎng)，考察其重復使用性能。每次進行催化后ADH酶的活性都能很快恢復，范圍在98％～101％之間。

簡介：在全球氣候變化的壓力下，生物能源的發(fā)展受到越來越多的關(guān)注，而沼氣厭氧發(fā)酵作為一種較為成熟的生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化方式，得到了極大地重視和快速地發(fā)展。如何提高沼氣發(fā)酵的效率，使其規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化成為了迫在眉睫的問題。溫度是制約厭氧發(fā)酵效率的一個重要因素，而利用太陽能給沼氣池加溫，不僅可以提高生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化效率，還可以減少對常規(guī)能源的過度依賴，有利于經(jīng)濟社會的可持續(xù)發(fā)展。本試驗嘗試利用太陽能給沼氣池加溫，以提高發(fā)酵效率。試驗在浙江省海寧市同仁養(yǎng)殖場沼氣工程中設(shè)計了面積為1008M2，可以儲存6T熱水的太陽能集熱裝置，利用可再生能源太陽能來加熱河水，再將加熱的河水輸入到發(fā)酵池中，以提高池溫，促進豬糞生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化率通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，加入太陽能熱水的沼氣池產(chǎn)氣率要比對照組提高112％，同時發(fā)現(xiàn)實驗組的沼氣成分與對照組之間沒有顯著差異。試驗期間實驗組通過太陽能加熱，比對照組產(chǎn)氣量增加2540M3，豬糞的能量轉(zhuǎn)化效率提高了143％。本研究利用太陽能提高豬糞生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化效率，從而降低了養(yǎng)殖場污染物的排放，減輕保護了當?shù)氐沫h(huán)境，促進了可持續(xù)發(fā)展；同時產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟效益，促進了當?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展。在我國廣大農(nóng)村地區(qū)，這種工程模式有很好的推廣價值。

簡介：因為半月板組織解剖結(jié)構(gòu)的獨特性所以半月板的損傷是很常見的骨科疾病而通過外科手術(shù)技術(shù)很少能真正地重建半月板組織。半月板是纖維軟骨組織由納米級膠原纖維交錯相連構(gòu)成半月板結(jié)構(gòu)的基本框架從微觀上觀察它又分為三層不同結(jié)構(gòu)構(gòu)成每一層結(jié)構(gòu)的膠原纖維有各自排列模式。半月板損傷后無血液供應部分不能再生所以研究人員嘗試利用組織工程技術(shù)來重建半月板。從目前國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)尚無一種單一材料和單一的制備技術(shù)能制備出具備半月板纖維軟骨組織特征的組織工程支架。應用復合材料的原理和方法將具有互補特性的兩種或兩種以上材料按一定比例和方式組合制成兼?zhèn)錂C械強度、可降解性和生物相容性的復合材料并選擇適宜的制備工藝可以設(shè)計構(gòu)造出能夠滿足組織工程支架所需的結(jié)構(gòu)和性能優(yōu)化的三維復合材料支架。目前復合材料種類繁多而天然生物材料與人工合成高分子材料之間的復合顯現(xiàn)了良好的組織相容性及生物力學特性適合應用在半月板這種組織構(gòu)造比較特殊的軟骨組織重建。在本課題中根據(jù)人工合成材料聚乳酸PLA具備一定的機械強度又有彈性符合半月板的“雙相”特性我們選用其作為生物材料中的基本成分為了增加它的可降解性將它與聚羥基乙酸PGA復合為了改善它的生物相容性我們又利用天然生物聚合物明膠對它進行表面修飾。同時考慮到組織工程支架的形貌結(jié)構(gòu)對引導細胞增殖方向誘導組織形成起到關(guān)鍵作用設(shè)計制備的支架就要很好地仿生組織的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。靜電紡絲技術(shù)能夠制備納米級的纖維結(jié)構(gòu)支架很好地仿生了細胞外基質(zhì)的膠原纖維結(jié)構(gòu)。根據(jù)前期工作改變接收板材質(zhì)為銅質(zhì)增加一個電場先行應用靜電紡絲技術(shù)制備聚乳酸聚羥基乙酸PLGA纖維結(jié)構(gòu)的支架作為支架基底層仿生半月板組織的細胞外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)再在PLGA纖維結(jié)構(gòu)支架表面紡一層明膠纖維結(jié)構(gòu)支架對PLGA進行表面修飾制成雙層結(jié)構(gòu)支架增加PLGA支架的親水性和組織相容性。制備的支架兼具機械強度、可降解性和組織相容性。鑒于靜電紡絲技術(shù)制備的支架達到一定厚度后因高分子材料的絕緣性和電場力的限制再想提高支架的厚度有相當大的挑戰(zhàn)。而熱致相分離TIPS技術(shù)使三維立體結(jié)構(gòu)支架的厚度得到大大地改觀改良的梯度熱致相分離技術(shù)又使支架孔隙的排列走向得到控制。我們選用有韌性可降解材料聚3羥基丁酸酯共聚4羥基丁酸酯POLY3HYDROXYBUTYRATEOCO4HYDROXYBUTYRATE簡稱P3HBCO4HB復合聚乳酸PLA改善PLA的降解性利用梯度熱致相分離技術(shù)制備PLAP3HBCO4HB取向孔隙三維支架再結(jié)合物理吸附作用將天然生物聚合物明膠涂覆在支架表面更加改善了支架的生物相容性使其具備誘導細胞取向增殖促進組織形成發(fā)揮組織工程支架的作用。第一部分靜電紡絲技術(shù)制備有機械強度和細胞相容性的雙層納米纖維結(jié)構(gòu)半月板組織工程支架目的1利用靜電紡絲技術(shù)制備組織工程支架。2通過明膠纖維的表面修飾提高支架生物相容性。3評估支架具備適合組織工程支架要求的物理化學性質(zhì)。方法在前期工作基礎(chǔ)上改進靜電紡絲設(shè)備將接收板改用銅質(zhì)材料并在接收板上增加一個新的電場利用“層層沉積”技術(shù)先紡出一層PLGA纖維結(jié)構(gòu)支架作基底層再紡制一層明膠GELATIN纖維結(jié)構(gòu)在其表面上沉積制備雙層結(jié)構(gòu)支架。同時以純的PLGA和明膠混合PLGA分別各紡出一種纖維支架作為對照組。將三種支架的表征、親水性、降解性和機械強度進行測試比較。結(jié)果GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架與另外兩種支架對比具備直徑合適的納米級纖維、有較大孔徑、較高的孔隙率、較高的親水性、滿意的降解率和良好的機械強度。結(jié)論明膠PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架仿生了半月板組織細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)具備作為組織工程支架的理化特性。第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化的半月板細胞種植支架聯(lián)合培養(yǎng)目的1提取兔的骨髓間充質(zhì)干細胞進行誘導分化為半月板細胞。2將細胞種植于前面制備的三種不同的纖維結(jié)構(gòu)支架上在體外進行培養(yǎng)。3觀察細胞在支架上的形態(tài)通過細胞增殖情況及合成分泌功能的比較分析評估不同支架的細胞相容性。方法應用密度梯度離心法提取兔骨髓間充質(zhì)干細胞在軟骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的纖維軟骨細胞通過表征觀察和特異性染色HE、甲苯胺藍、ABPAS、Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色進行鑒定。接種細胞于三種不同支架通過觀察細胞表征、組織染色、增殖測試評估三種不同支架對細胞的相容性及對細胞特性的保持。結(jié)果提取的骨髓間充質(zhì)干細胞可以誘導分化成半月板纖維軟骨細胞種植于支架后能夠增殖并保持纖維軟骨細胞的表征和功能尤其在明膠PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架上增殖顯著。結(jié)論明膠PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架接種經(jīng)誘導分化的纖維軟骨細胞的聯(lián)合培養(yǎng)為組織工程技術(shù)重建半月板提供理論依據(jù)。第三部分制備具有生物相容性和機械強度的GELATINPLAP3HBCO4HB三維組織工程支架目的1改進的梯度熱致相分離技術(shù)制備PLAP3HBCO4HB三維多孔取向支架。2在支架表面吸附明膠GELATIN進行修飾制備的支架進行表征、親水性、降解性和機械強度的測試評估。3支架上種植前面獲得的誘導分化的骨髓間充質(zhì)干細胞評估支架的細胞相容性。4與第一部分制備的GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架進行機械強度和細胞相容性方面的對比。方法應用改進的梯度熱致相分離技術(shù)制備PLAP3HBCO4HB三維多孔支架用物理吸附方法以明膠對支架進行表面修飾標記為GELATINPLAP3HBCO4HB支架制備的支架與未經(jīng)過修飾的PLAP3HBCO4HB支架進行表征、孔隙率、降解性、親水性和機械力學性能的測試對比后種植經(jīng)誘導分化的骨髓間充質(zhì)干細胞通過觀察細胞在支架上的生長及細胞一支架復合體的特異性染色和掃描電鏡、共聚焦顯微鏡觀察情況進行對比分析評估明膠修飾支架在細胞相容性方面的優(yōu)越性。為了選擇更優(yōu)越的支架再與第一部分制備的GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架進行拉伸強度和細胞種植支架增殖情況的對比。結(jié)果梯度熱致相分離技術(shù)制備的三維多孔支架經(jīng)明膠修飾后具備較理想的理化性質(zhì)種植其上的經(jīng)誘導分化的骨髓間充質(zhì)干細胞能夠很好地增殖并保持纖維軟骨表征。與GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架對比有更強的機械強度和優(yōu)越的細胞相容性。結(jié)論相比GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架明膠修飾的PLAP3HBCO4HB三維立體結(jié)構(gòu)支架更適于成為半月板組織工程支架。第四部分GELATINPLAP3HBCO4HB支架負載誘導分化的干細胞植入裸鼠體內(nèi)構(gòu)建纖維軟骨的實驗研究目的檢測細胞一支架復合體植入裸鼠皮下構(gòu)建纖維軟骨組織。方法首先測試支架的安全性用支架浸提液進行皮下刺激試驗和急性毒性實驗。然后將前面實驗中已經(jīng)得到的經(jīng)示蹤劑染色的誘導分化干細胞負載于支架上構(gòu)成復合體與單純無細胞支架植入裸鼠皮下進行培養(yǎng)4周后在多功能活體成像系統(tǒng)下觀察確認支架內(nèi)細胞存活、增殖。將裸鼠處死取出細胞一支架復合體制成切片進行組織染色和免疫組化染色觀察對比。結(jié)果制備的GELATINPLAP3HBCO4HB支架是有生物相容性的是安全的。負載誘導分化干細胞的支架植入裸鼠皮下后可見支架內(nèi)被標記的細胞增殖明顯細胞融合相互聯(lián)系分泌纖維軟骨細胞外基質(zhì)。在支架環(huán)境中有半月板纖維軟骨組織形成的趨勢。結(jié)論負載誘導分化干細胞的GELATINPLAP3HBCO4HB支架于裸鼠皮下培養(yǎng)成纖維軟骨組織為組織工程技術(shù)重建半月板提供理論依據(jù)。

簡介：多殺菌素SPINOSAD是由刺糖多孢菌SACOPOLYSPASPINOSA經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物屬新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。多殺菌素被認為是繼阿維菌素之后最為有效的生物殺蟲劑成為新型生物農(nóng)藥研發(fā)的熱點。然而由于其發(fā)酵單位低、副產(chǎn)物多、產(chǎn)品收率低導致生產(chǎn)成本高制約了其工業(yè)化生產(chǎn)和全面推廣應用。因此本研究通過代謝工程的方法對多殺菌素的合成途徑進行了改造此外還對多殺菌素合成過程中的一些關(guān)鍵問題作了研究。主要研究結(jié)果如下1本研究成功的建立了適合特定大小質(zhì)粒的刺糖多孢菌的基因操作系統(tǒng)。本研究通過已建立的刺糖多孢菌操作系統(tǒng)成功的利用一種理性設(shè)計的手段對多殺菌素合成途徑進行了改造。首先為了使帶有鼠李糖糖苷配基的大環(huán)RAGL更多的朝著PSA合成的方向進行基因SPNK在刺糖多孢菌中被過表達了。然后為了解決福樂糖胺合成量不夠的問題參與福樂糖胺合成的六個基因SPNPSPNOSPNNSPNQSPNR和SPNS和SPNK被共同表達在這株基因工程菌中使得積累的PSA轉(zhuǎn)化成了多殺菌素。為進一步提高多殺菌素的產(chǎn)量在基因工程菌LU104中過表達了GTTGDHKRESPNPSPNOSPNNSPNQSPNRSPNS和SPNK基因后多殺菌素的產(chǎn)量達到了405MGL產(chǎn)量較野生菌株提高了5倍。2在本工作中選擇了8個可能的參照基因16SRRNAGAPDHTUFAHPRTRBL13RPOBUBQ和HRDB。用三個標準化算法BESTKEEPERGENM和NMFINDER對這8個備選參照基因進行數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示在不同刺糖多胞菌株和不同培養(yǎng)條件下16SRRNA和RBL13的表達量均穩(wěn)定為最佳參照基因。而在鏈霉菌中常用的GAPDH和RPOB基因則不適合作為刺糖多胞菌中RTQPCR數(shù)據(jù)標準化的參照基因。3本研究在基因水平和代謝物水平從脂肪酸Β氧化脂肪酸從頭合成和多殺菌素合成的角度解釋外源脂肪酸的添加可以提高多殺菌素產(chǎn)量的原因。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多殺菌素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A的濃度增加導致多殺菌素產(chǎn)量的提高。本研究建立了在添加外源脂肪酸的情況下Β氧化脂肪酸從頭合成和多殺菌素合成之間的代謝關(guān)系。本研究的結(jié)果使研究人員能更好的理解添加脂肪酸可以提高聚酮化合物產(chǎn)量的原因。

簡介：目前，因創(chuàng)傷、先天性畸形、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和腫瘤等原因造成的骨缺損疾病對骨移植材料的需求日趨增加。當前常用的骨修復材料包括自體骨移植物、異種或同種異體骨移植物以及人工合成的骨替代材料，然而這些材料均存在一定的缺陷或局限性。自體骨移植一直被視為治療骨缺損的“黃金法則”，但它受限于來源，并且存在著引起供區(qū)正常骨結(jié)構(gòu)破壞、感染和疼痛等潛在問題。異種或同種異體骨移植物具有免疫原性，會引發(fā)機體的免疫排斥反應，還可能導致病原體傳染。傳統(tǒng)的人工合成的骨替代材料，如羥基磷灰石或磷酸鈣陶瓷，雖然可以避免生物源性移植物的缺陷，但其僅具有填充、支持和骨傳導作用，不具有高的生物活性，尤其骨誘導能力弱，不能形成“活”的具有生物功能的骨組織。如何理想地實現(xiàn)骨缺損的修復，一直是臨床研究的熱點和難點。如今，骨組織工程為骨缺損的修復提供了重要的選擇性策略。支架材料作為人工細胞外基質(zhì)材料是骨組織工程的核心。根據(jù)天然骨的結(jié)構(gòu)和組成，天然聚合物羥基磷灰石復合支架材料成為了研究熱點。生物可降解的天然衍生高分子聚合物殼聚糖CHITOSAN，由于其良好的生物相容性，生物可降解性，正電性，易化學改性性而成為僅次于膠原的最具有潛力的用于骨組織工程支架材料的天然聚合物。目前，殼聚糖羥基磷灰石骨組織工程支架材料的制備方法主要基于混合共沉淀法和原位共沉淀法。以上制備方法雖然工藝簡單，卻很難在一個具有復雜結(jié)構(gòu)的三維支架內(nèi)實現(xiàn)表面化學組成和微觀結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)，且使用的交聯(lián)劑戊二醛有毒，其在體內(nèi)降解過程中很容易釋放出來。此外，為了獲得與骨組織結(jié)構(gòu)類似來達到理想的力學性能和生物活性的骨支架材料，生物礦化方法已成為實現(xiàn)形貌和結(jié)晶度與天然骨相似的磷灰石在天然聚合物自組裝的重要策略。然而，目前很難利用類似在膠原表面進行生物礦化的方法實現(xiàn)羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面組裝。因此，通過一種無毒且可控的方法實現(xiàn)具有生物活性的羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面精確組裝仍然是骨組織工程的重要挑戰(zhàn)。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞BMSCS，作為一種成體干細胞，因具有低的免疫原性、易獲取性和多向分化潛能性已成為骨組織工程中最為理想的種子細胞之一。近來研究表明生物材料的表面特征，包括化學組成、粗糙度、微結(jié)構(gòu)，特別是納米級微結(jié)構(gòu)，可以直接影響干細胞的命運。因此，了解骨髓間充質(zhì)干細胞在支架微環(huán)境的生理反應，可以在分子水平明確支架微環(huán)境對細胞行為的影響，這為骨髓間充質(zhì)干細胞在骨組織工程的應用提供了理論依據(jù)并有助于研發(fā)具有特定生物活性的組織誘導性支架材料。而且，目前隨著干細胞與生物材料表面微環(huán)境相互作用的逐步廣泛認識，組織工程逐步朝向設(shè)計和工程化具有促進細胞特殊表型表達功能的支架材料表面的方向發(fā)展。此外，骨支架材料的表面特征，特別是考慮到對生長因子例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，BMP2的持續(xù)釋放，或許能夠提供一種新型而有效的藥物釋放系統(tǒng)來達到促進成骨的目的。根據(jù)上述背景，本論文旨在通過一種無毒且可控的方法實現(xiàn)具有生物活性的羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面精確組裝，并探討該復合支架材料的表面微環(huán)境對接種的干細胞體外成骨分化潛能以及對成骨生長因子如BMP2緩釋能力的影響，提供一種具有潛在應用價值的骨組織工程支架材料。本論文主要包括以下幾個方面的工作1二級三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)殼聚糖羥基磷灰石骨組織工程支架材料HGCCS的構(gòu)建及細胞生物相容性表征使用無毒的交聯(lián)劑京尼平GNEIPIN，根據(jù)納米籽晶誘導的仿生礦化方法，利用水熱合成、原位復合和冷凍干燥制備技術(shù)，實現(xiàn)了羥基磷灰石在殼聚糖支架表面的組裝，并成功地制備了具有二級三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖網(wǎng)絡(luò)HAP骨組織工程支架材料HGCCS第一級網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為殼聚糖支架構(gòu)成的三維連通的多孔結(jié)構(gòu)約150ΜM，利于細胞遷移和物質(zhì)傳輸?shù)诙壘W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是由羥基磷灰石在孔道表面自組裝形成的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（約150NM），為細胞的生長和生理功能提供了特殊的微環(huán)境。X射線衍射XRD、高分辨投射電鏡HRTEM和傅里葉變化紅外光譜FTIR分析證實了在HGCCS孔道表面上連續(xù)的納米結(jié)構(gòu)是由結(jié)晶性的羥基磷灰石組成。使用的無毒交聯(lián)劑京尼平，賦予了復合支架材料特有的熒光特性和高的力學強度。羥基磷灰石納米籽晶的摻入促進了羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在支架孔道表面的快速組裝，且共同起到了增強支架材料力學性能的作用。HGCCS的彈性模量EM高達5049±223MPA。利用京尼平與殼聚糖共聚物的熒光特性，開發(fā)了其在支架材料成像與示蹤以及支架材料降解過程中結(jié)構(gòu)觀察的潛在應用。此外，其熒光特性或許為研究細胞與支架材料之間的相互作用，以及觀察細胞在支架表面的黏附、定位和遷移提供了一個有效手段。將前成骨細胞MC3T3E1接種于京尼平交聯(lián)的殼聚糖支架GCF和HGCCS上體外培養(yǎng)3天后，通過掃描電鏡SEM對細胞形貌的觀察以及通過激光掃描共聚焦顯微鏡CLSM對細胞核和細胞骨架染色后進行觀察，證實了GCF和HGCCS具有良好的細胞生物相容性。將提取的大鼠BMSCS接種于支架材料內(nèi)，通過細胞形貌和細胞骨架組裝觀察以及細胞增殖實驗，進一步證實了HGCCS具有良好的細胞生物相容性。此外，胎牛血清蛋白FETALCALFSERUM，F(xiàn)BS作為模式蛋白被用于評價了HGCCS的蛋白吸附性能。相比于GCF和京尼平交聯(lián)的殼聚糖納米羥基磷灰石復合物GCGF，HGCCS特有的孔道表面特征，包括高的比表面積、納米尺寸的結(jié)晶度以及微孔隙度促進了FBS在支架材料表面的吸附，并為BMSCS的生長獲得了更多的營養(yǎng)。FBS在三種支架材料上的吸附結(jié)果也進一步支持了細胞增殖結(jié)果。2體外評價BMSCS在HGCCS上的成骨分化潛能體外評價了BMSCS在HGCCS上的成骨分化潛能。在相同的體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7天后，BMSCS在GCF和HGCCS上的細胞形狀和細胞骨架組裝均呈現(xiàn)出顯著的差異。BMSCS在GCF上呈現(xiàn)出成纖維形貌，具有BMSCS的典型表型，而BMSCS在HGCCS上的多角的形狀類似成骨細胞的表型。堿性磷酸酶ALP作為成骨重要標志物之一，其活性檢測結(jié)果表明HGCCS誘導了更高的ALP活性?；趯崟r定量PCRRTPCR檢測，HGCCS誘導了成骨分化標志物在MRNA水平的最高表達，分別是第7天的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，第7天的骨橋蛋白OPN和第14天的骨鈣素OCN。分別培養(yǎng)7天和14天后，茜素紅染色結(jié)果證實了BMSCS在HGCCS上具有促進礦化基質(zhì)和鈣結(jié)節(jié)形成的能力。在相同的體外培養(yǎng)條件下，相比于GCF，HGCCS表面的羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為重要的信號因素促進了BMSCS的體外成骨分化。3基于具有二級三維多孔結(jié)構(gòu)的殼聚糖羥基磷灰石復合支架的表面微結(jié)構(gòu)調(diào)控BMP2緩釋及促進BMSCS體外成骨分化體外評價了HGCCS表面特殊的羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對BMP2的吸附和長期釋放作用以及對大鼠BMSCS體外成骨分化潛能的影響。酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA結(jié)果表明，與對照組GCF的28％的BMP2載藥率相比，HGCCS具有65％的有效載藥率。ELISA結(jié)果還表明BMP2從HGCCS可持續(xù)釋放到第14天，而在第1和第3天BMP2在GCF上呈現(xiàn)出爆發(fā)式地釋放。進而，BMP2從HGCCS的緩釋能力促進了體外BMSCS的ALP活性增加?；趯崟r定量PCR檢測，BMP2荷載的HGCCS也誘導了成骨分化標志物在MRNA水平的最高表達，分別是第14天的RUNX2，第3天的OPN和第14天的OCN。本次研究結(jié)果證實具有二級三維多孔結(jié)構(gòu)的HGCCS的表面羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為BMP2的荷載系統(tǒng)可以促進BMSCS的體外成骨分化，表明HGCCS是具有潛在應用價值的骨組織工程支架材料。4豬脫細胞真皮基質(zhì)PADM羥基磷灰石復合支架材料對大鼠顱骨臨界骨缺損修復性能的初步研究課題組前期首次利用PADM作為基礎(chǔ)材料體外構(gòu)建了具有二級三維多孔結(jié)構(gòu)的天然膠原羥基磷灰石復合支架材料，并研究了其對大鼠下頜骨臨界骨缺損的修復性能。在前期研究基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了8MM大鼠顱骨臨界骨缺損模型用于評價PADM和PADMHAP的成骨生物活性。修復5周后，MICROCT分析和組織化學染色結(jié)果表明相比于PADM，PADMHAP具有更好的骨修復能力。

簡介：國內(nèi)圖書分類號TK6國際圖書分類號625碩士學位論文學校代碼10079密級公開生物質(zhì)有機廢棄物水熱解機理及資源化工程利用研究碩士研究生導師申請學位學科專業(yè)所在學院答辯日期授予學位單位曾其林李大中教授工學碩士控制科學與工程控制理論與控制工程控制與計算機工程學院2013年3月華北電力大學華北電力大學碩士學位論文原OIL“L聲明本人鄭重聲明此處所提交的碩士學位論文生物質(zhì)有機廢棄物水熱解機理及資源化工程利用研究，是本人在導師指導下，在華北電力大學攻讀碩士學位期間獨立進行研究工作所取得的成果。據(jù)本人所知，論文中除已注明部分外不包含他人己發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究工作做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式注明。本聲明的法律結(jié)果將完全由本人承擔。作者簽名＼萄頭揀日期％I≥年≥月7日華北電力大學碩士學位論文使用授權(quán)書生物質(zhì)有機廢棄物水熱解機理及資源化工程利用研究系本人在華北電力大學攻讀碩士學位期間在導師指導下完成的碩士學位論文。本論文的研究成果歸華北電力大學所有，本論文的研究內(nèi)容不得以其它單位的名義發(fā)表。本人完全了解華北電力大學關(guān)于保存、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向有關(guān)部門送交論文的復印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱一。本人授權(quán)華北電力大學，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文，可以公布論文的全部或部分內(nèi)容。本學位論文屬于請在以下相應方框內(nèi)打“寸’保密口，在T年解密后適用本授權(quán)書不保密叮作者簽名導師簽名博其株日期WL；年≥月7日日期跏B年弓月拿日

簡介：目的探討基于乙肝病毒核心蛋白HBC的改造位點及形式，使形成攜帶細胞穿膜肽或配體的核心顆粒，以作為HBV感染模型改造的基礎(chǔ)。方法1用不依賴酶切連接的分子克隆方法RLIC構(gòu)建HBC、HBV11C及各種HBC改造質(zhì)粒。2將各種HBC重組體與HBV11C共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，通過提取細胞內(nèi)核心顆粒DNA，SOUTHERNBLOT檢測DNA中間體，來判斷相應基因工程改造HBC是否支持HBV復制，形成包裹核酸的核心顆粒。結(jié)果1成功構(gòu)建在HEK293細胞內(nèi)有效支持HBV復制的WTHBC與HBV11C反式互補系統(tǒng)2HBC釘突部位AA7980缺失或替換不支持HBV復制3HBCAA8693缺失或替換后功能缺陷4HBCN末端插入短肽后能以較低水平支持HBV復制5HBCN末端可作為普遍有效的融合位點，用ABC接頭連接，可支持長片段EGFP238AARFP225AA、VSVG511AA融合。結(jié)論我們構(gòu)建了有效的HBC與HBV11C反式互補系統(tǒng)，該系統(tǒng)可檢測各種改造的HBC是否具有包裹核酸形成核心顆粒類病毒VLPS的功能。利用該系統(tǒng)，我們檢測到HBCAA7980及AA8693缺失或替換后均存在功能缺陷，這些序列可能與HBC的完整結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)。N末端可作為有效的改造位點，支持各種長度的外源蛋白融合，可長達511AA。

簡介：為了應對石油等不可再生資源短缺的現(xiàn)狀，減少橡膠工業(yè)對化石資源的依賴，本課題通過分子設(shè)計和化學合成的方法制備了一種不依賴于石油資源的聚酯彈性體材料，其最大的特點就是采用分階段加料，通過雙鍵封端后再交聯(lián)的辦法改善了傳統(tǒng)方法制備的聚酯彈性體交聯(lián)點密度較低的缺點。選用13丙二醇，1，4丁二醇和癸二酸這三種生物質(zhì)單體，通過熔融縮聚的方法制備了較低分子量的端羥基聚酯，酸值測定結(jié)果顯示產(chǎn)物的端基以羥基為主，除了醇酸比13∶1，聚酯中雙端羥基組分含量均高于50％。并考察了反應溫度、反應時間、原料配比對目標聚酯相對分子質(zhì)量的影響，并選擇醇酸比15∶1，150℃下縮聚4小時作為合成端羥基聚酯的反應條件。之后以與端羥基聚酯摩爾比1∶2的比例加入封端單體丙烯酸，在聚酯兩端引入雙鍵，并通過紅外光譜和核磁共振氫譜對雙鍵的引入情況進行了檢測，紅外結(jié)果顯示封端后3445CM1處的OH特征峰明顯降低，同時在1631CM1處出現(xiàn)了CC雙鍵特征峰核磁結(jié)果顯示OH峰在封端后幾乎消失，兩項測試結(jié)果均表明丙烯酸單體和端羥基發(fā)生了反應，CC雙鍵被成功引入。最后以過氧化二異丙苯DCP為交聯(lián)劑，將雙鍵封端聚酯同三烯丙基異氰脲酸酯TAIC以一定配比制備了一系列彈性體材料，研究了雙鍵封端聚酯和TAIC投料比對該彈性體性能的影響，結(jié)果顯示雙鍵封端聚酯和TAIC摩爾比為3∶2時，彈性體具有最高的凝膠含量757％和最高的拉伸強度，且DSC和XRD曲線未出現(xiàn)明顯結(jié)晶峰。添加納米SIO2粒子進行增強，并采用模壓成型，制備出了具有不同填料份數(shù)的BEE復合材料。DSC測試結(jié)果表明，SIO2的加入對升溫結(jié)晶有抑制作用，且隨著SIO2份數(shù)的增加結(jié)晶性能下降。TEM和SEM結(jié)果顯示納米SIO2在橡膠基體中分散較為均勻，表明橡膠基體與填料間具有良好的界面結(jié)合。力學測試結(jié)果表明，加入SIO2補強之后拉伸強度由07MPA上升到十幾MPA，且具有與已工業(yè)化的橡膠產(chǎn)品相近的優(yōu)良力學性能。BEE30PHRSIO2復合材料的透氣系數(shù)為3481017PM2S1PA1，低于含相同份數(shù)填料的丁苯橡膠和天然橡膠，表明BEE復合材料具有較好的氣體阻隔性能。

簡介：學號2012309041分類號TP3115研究生類別全日制碩士碩士學位論文（專（專業(yè)學位）位）論文題目目生物工程領(lǐng)域內(nèi)的在線紅外光譜數(shù)據(jù)分生物工程領(lǐng)域內(nèi)的在線紅外光譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)析系統(tǒng)專業(yè)專業(yè)學位學位名稱工程名稱工程碩士碩士方向領(lǐng)域名稱軟件工程方向領(lǐng)域名稱軟件工程申請人姓名王麗娜王麗娜指導教師高玲高玲于治樓于治樓論文提交時間論文提交時間2014年5月30日獨創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得（注如沒有其他需要特別聲明的，本欄可空）或其他教育機構(gòu)的學位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名學位論文版權(quán)使用授權(quán)書學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學校學?？梢詫W位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。（保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書）學位論文作者簽名導師簽字簽字日期20年月日簽字日期20年月日

簡介：人生長激素HUMANGROWTHHMONE，HGH對人體的生長和發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，生長激素的缺乏會導致生長障礙等疾病的發(fā)生，含HGH類藥物可治療上述疾病。目前，臨床應用的HGH主要通過DNA重組技術(shù)在大腸桿菌ECOLI中表達獲得。酵母屬于真核生物，在真核蛋白表達和分離純化工藝方面比大腸桿菌更有優(yōu)勢。本文選用畢赤酵母表達系統(tǒng)，通過構(gòu)建高效表達的重組人生長激素RECOMBINANTHUMANGROWTHHMONE，RHGH工程菌、優(yōu)化表達條件、研究分離純化工藝，并初步測定其生物學作用。本文對HGH的CDNA序列進行設(shè)計和優(yōu)化，并進行人工合成，采用3種質(zhì)粒PPIC9、PPIC9K、PPICZΑA作為目的基因的表達載體，通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至3種畢赤酵母X33、GS115、SMD1168中進行表達，并對不同載體宿主組合的表達量差異進行比較。采用表達量最高的組合X33和PPICZΑA組合，簡稱XZΑ進行了1L搖瓶和3L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對其分離純化工藝進行研究，最后在體外對RHGH的生物學作用進行初步測定。研究結(jié)果包括1研究不同載體宿主組合對RHGH表達量的影響，結(jié)果表明，在X33與PPICZΑA組合時RHGH表達量達到最高。2對1L和3L規(guī)模的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，在1L搖瓶規(guī)模時，最佳誘導溫度和PH為23℃和PH60在23℃、PH60進行3L發(fā)酵罐發(fā)酵時，當采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BASALSALTSMEDIUM，BSM時表達量最高為3000MGL左右，較大腸桿菌表達RHGH的量高。3對RHGH分離純化工藝進行研究，最終經(jīng)高速冷凍離心、雙水相、超濾以及離子交換層析處理后，獲得了收率大于60％，純度高于90％的RHGH。4對獲得的RHGH初步進行生物學活性測定，結(jié)果表明，RHGH對人正常肝細胞QSG7701和人肝癌細胞BEL7402的生長和增殖具有促進作用。本研究獲得的RHGH具有表達量高，純化工藝簡單等優(yōu)點，并初步研究其生物學作用，為RHGH的畢赤酵母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

簡介：華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文密級畢赤酵母瞎基工程改造及WFDC2生物學活曲榭THERESEARCHOFGLYCOSYLATIONENGINEERINGINPICHIAPASTORISANDCHARACTERIZATIONOF、ⅦDC2博士研究生學號指導教師指導小組華玲201130201003L操繼躍教授操繼躍教授何啟蓋教授邱銀生教授丁明星教授王大菊教授周洪波教授專業(yè)基礎(chǔ)獸醫(yī)學研究方向獸醫(yī)藥理學與毒理學獲得學位名稱農(nóng)學博士獲得學位時間2014年12月華中農(nóng)業(yè)大學動物科學院與動物醫(yī)學院二。一四年十二月畢赤酵母糖基工程改造及WFDC2生物學活性的探討目錄摘要IABSTRACTIII縮略詞表VI前言11畢赤酵母表達系統(tǒng)111畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點112酵母的N糖基化途徑213畢赤酵母N糖基化改造的研究進展52糖基化對蛋白藥物的影響73乳清酸4二硫化蛋白WFDC2～84本課題的研究目的11第一章畢赤酵母糖基工程改造12一畢赤酵母糖基工程改造刈CHL基因的敲除12前言121材料1211菌種與質(zhì)粒一1212工具酶、抗體1213主要試劑及試劑盒一1314主要儀器一1315培養(yǎng)基1516主要溶液162試驗方法1721PZBMFC2正反向篩選載體的構(gòu)建和鑒定一1722畢赤酵母KM71OCHL基因敲除質(zhì)粒PBMZOCHL的構(gòu)建和鑒定2423敲除畢赤酵母KM71的OCHL基因2824OCHL基因敲除菌株的表型鑒定2925表達載體PPICZAAWFDC2的構(gòu)建30

簡介：西南交通大學碩士學位論文物化與生物組合工藝及其在印染廢水工程中的應用研究姓名周長玖申請學位級別碩士專業(yè)環(huán)境工程指導教師付永勝鄧良偉20030401西南交通大學碩士研究生學位論文第1T頁ABSTRACTTHEIMPORTANTPARTSOFENVIRONMENTPOLLUTIONAREWATERPOLLUTIONINWORLDPRINTINGDYEINGWASTEWATERISAMAJORPARTOFINDUSTRIALWATERPOLLUTION，POSSESSING“THREEHIGHONEDIMCULTONECHANGE”CHARACTERSOFHIGHCHROMATIONHIGHBIOCHEMICALINDEX，HIGHPH，DIFFICULTLYREDUCING，CHANGINGPARAMETERBASEDONDATAANALYSIS，DETERMININGTESTPLAN，CARRYINGOUTLOCALTESTANALYSIS，RESEARCHINGCHARACTERISTICOFPRINTINGDYEING，KINETICSOFBIOCHEMICALTREATMENTANDCORNPLEXPROCESSOFWASTEWATERTREATMENTUSINGNEUTRALIZATIONTHEORYPHYSICALCHEMISTRYANAEROBICANDAEROBICTECHNOLOGYTHEPROCESSWASUTILIZEDTOTHEPROJECTOFWASTEWATERTREATMENTINCHENGDUSHUANGJIPRINTINGDYEINGFACTORYTESTINGPHCHANGINGFORWASTEGASNEUTRALIZATION，CHROMATIONREMOVALFORCHEMICALFLOCCULATION，BIOCHEMICALINDEXFORABRANDREMOVALRATEOFORGANICMATTERFORSBRTHERESULTSISTHATINWASTEG觴NEUTRALIZATIONUNIT，PHCHANGESFORM105TO80INCHEMICALFLOCCULATIONUNITREMOVALRATEOFCHROMATIONCODANDBODIS60％AND60％AND30％INABRUNIT，REMOVALRATEOFCHROMATION，CODANDBODIS57％AND45％AND30％INSBRUNITREMOVALRATEOFCHROMATIONCODANDBODIS66％AND83％AND93％INWHOLECOMPLEXPROCESS，REMOVALRATEOFALLPOLLUTIONINDEXESISUPTO90％。A11PARAMETERSINTREATEDWASTEWATERISUPTODISCHARGELEVEL11LERESULTSFORAPPLYINGTHECOMPLEXPROCESSINACTUALENGINEERINGPROJECTSJSTHEFACTTHATCONFIRMSTHEVALIDITYOFWASTEGASNEUTRALIZATION，THEPMCTICABILITYOFFLOCCULATINGTECHNOLOGYTHEPROGRESSOFABRTECHNOLOGYANDTHERATIONALITYOFSBRTECHNOLOGYINDICATESTHATTHENEWPROCESSPROVIDES血ELOWRURMINGCOSKSIMPIEMANAGEMENTHIGHREMOVALRATEFORTHECHROMATIOM，BOD5，COD，SSINWASTEWATERTHEREBYTHENEWPROCESSWILIBECOMEACOMMENDATORYPROCESSFORTREATINGPRINTINGDYEINGWASTEWATERKEYWORDSFLOCCUATION，ABR／SBR，NEWCOMPLEXPROCESS，ENGINEERINGAPPLICATION

簡介：隨著化石能源日益消耗，生物乙醇受到越來越多的關(guān)注。利用耐熱酵母KLUYVEROMYCESMARXIANUS進行同時糖化與發(fā)酵SSF生物質(zhì)既能提高生物質(zhì)的利用率又能降低發(fā)酵過程中的能源成本。本課題對KMARXIANUS菌株進行基因工程操作改造以提高其對木糖和淀粉的發(fā)酵能力。為了提高KMARXIANUS的木糖發(fā)酵能力，我們克隆了木糖還原酶（KMXYL1），木糖脫氫酶（KMXYL2）和木酮糖激酶（KMXYL3）3個基因并進行性質(zhì)研究，敲除KMARXIANUSYHJ010菌株的木糖還原酶基因和木糖脫氫酶基因使YHJ010菌株失去木糖利用能力得到Y(jié)RL002菌株，再通過引入來自PINOMYCES的的木糖異構(gòu)酶基因XYLA使YRL002菌株重新獲得木糖利用能力并得到Y(jié)RL003菌株。通過在木糖合成培養(yǎng)基中馴化提高木糖利用能力，得到Y(jié)RL005菌株。YRL005菌株在木糖培養(yǎng)基中生長速率可達0137H，并能在42℃發(fā)酵3015GL木糖生產(chǎn)1152GL乙醇，在45℃發(fā)酵166GL木糖生產(chǎn)521GL乙醇。除此之外，YRL005菌株還能利用玉米芯水解液在42℃發(fā)酵2004GL木糖獲得825GL乙醇。YRL005菌株是一個很好的發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的耐熱酵母平臺。KMARXIANUS并不能直接發(fā)酵淀粉。在KMARXIANUSYZB010菌株中表達ASPERGILLUSYZAE來源的Α淀粉酶和DEBARYOMYCESOCCIDENTALIS來源的Α淀粉酶和糖化酶，獲得了可在較高溫度下＞40℃利用未經(jīng)糊化的生淀粉發(fā)酵的YRL009菌株。在42℃，YRL009菌株發(fā)酵200GL木薯淀粉生產(chǎn)6652GL乙醇。如果提高起始接菌量，產(chǎn)量可達理論產(chǎn)值的783％7995GL，而在45℃和48℃，發(fā)酵200GL木薯淀粉可分別生產(chǎn)5536GL和3216GL乙醇。除此之外，YRL009菌株還可以直接發(fā)酵木薯干粉。在不添加任何營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，200GL木薯干粉（實含17852GL木薯淀粉）可生產(chǎn)6973GL乙醇。YRL009菌株，是已發(fā)表文獻中是最好的能夠利用生淀粉的耐熱CBP酵母菌株。

簡介：異戊二烯是自然界分布最為廣泛、種類最為多樣化的大類生物有機化合物類異戊二烯的合成單體，同時作為合成化學工業(yè)的基礎(chǔ)原料，被廣泛應用于合成橡膠、醫(yī)藥、香料和農(nóng)藥等領(lǐng)域。目前工業(yè)上異戊二烯的供應主要依賴于石油基原料，其綠色清潔生產(chǎn)仍然是當前可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中的一大挑戰(zhàn)。大腸桿菌和釀酒酵母遺傳背景清楚、操作簡便，是工業(yè)生產(chǎn)中的理想模式微生物。因此，本研究采用大腸桿菌和釀酒酵母作為宿主菌，對微生物中異戊二烯的生物合成進行研究。在利用大腸桿菌生物合成異戊二烯的研究中，首先，通過引入外源的異戊二烯合酶在大腸桿菌中構(gòu)建一條異戊二烯生物合成途徑，并通過單個基因的過表達，確定了MEP途徑中的關(guān)鍵酶（DXSDXR和IDI），其影響力順序為IDI＞DXS＞DXR其次，結(jié)合不同相容質(zhì)粒共存體系及多順反子方法，構(gòu)建了載體形式的多基因共表達體系，實現(xiàn)了ISPS、DXS、DXR、IDI多個限速酶的共表達，并就多基因協(xié)同作用對代謝產(chǎn)物的影響進行了探索然后，采用基因順序調(diào)控對MEP途徑進行了平衡調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因的表達順序?qū)Ξ愇於┑慕K產(chǎn)量具有重要影響，當基因表達順序與代謝途徑順序一致時，代謝產(chǎn)物積累量最高最后，結(jié)合蛋白質(zhì)工程和代謝工程，提出了關(guān)鍵酶的共定向進化策略，異戊二烯的生產(chǎn)率提高了60％，達到418MGG1H1細胞干重，DCWDRYCELLWEIGHT。在利用釀酒酵母作為工程菌株生產(chǎn)高附加值生物化學品時，多基因途徑的快速、穩(wěn)定組裝是生物合成中的一大瓶頸。為此，我們首先建立了一套即插即用、選擇標記可循環(huán)使用的整合工具盒PUMRI。為了證實其有效性，將其應用于構(gòu)建4個基因的Β胡蘿卜素合成途徑～10KBDNA，8個基因的MVA途徑～17KBDNA和11個基因的番茄紅素生物合成途徑～22KBDNA。結(jié)合GAL調(diào)控系統(tǒng)，最終獲得了兩株類異戊二烯高產(chǎn)菌株，其中YCAROTENE01菌株的胡蘿卜素含量達到163MGGDCW，BY4742C04菌株的角鯊烯含量達到39MGGDCW。作為MVA途徑的前體物質(zhì)，乙酰輔酶A的充足供應對于類異戊二烯的積累是非常重要的，為此我們就細胞質(zhì)和線粒體兩個亞細胞結(jié)構(gòu)進行了代謝工程調(diào)控。在細胞質(zhì)的調(diào)控中，我們針對MVA途徑、乙酰輔酶A合成途徑及異戊二烯合成支路三個代謝模塊，提出了推拉敲的組合調(diào)控策略，確定并解除了各個模塊中的限速節(jié)點。綜合調(diào)控后異戊二烯的產(chǎn)量達到185MGL，提高了394倍。在線粒體的調(diào)控中，首先，以GFP作為報告基因進行了熒光定位表征，建立了線粒體的基因定位策略。然后，將線粒體定位序列引入PURMI工具盒，在線粒體內(nèi)構(gòu)建了一條MVA途徑。為了提高異戊二烯的產(chǎn)量并緩解MVA途徑在線粒體內(nèi)構(gòu)建后造成的中間代謝積累對細胞生長造成的毒性，采用了GAL調(diào)控和好氧調(diào)控策略，異戊二烯的產(chǎn)量達到133MGL，該結(jié)果證實了線粒體調(diào)控的有效性。最后，將線粒體和細胞質(zhì)兩個亞細胞結(jié)構(gòu)域進行了協(xié)同調(diào)控，最終異戊二烯的產(chǎn)量達到158MGL。本文以多基因表達方法及整合工具的建立為基礎(chǔ)，結(jié)合蛋白質(zhì)工程及多種代謝調(diào)控策略，有效地提高了微生物中的異戊二烯的生物合成效率，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

簡介：WUHANINSTITUTEOFTECHNOLOGY碩士學位論文碩士學位論文啤酒污泥生物營養(yǎng)劑的制備及工程啤酒污泥生物營養(yǎng)劑的制備及工程化應用研究化應用研究學科專業(yè)學科專業(yè)環(huán)境工程環(huán)境工程研究生生劉政指導教師指導教師明銀安明銀安副教授副教授校外導師楊文斌校外導師楊文斌高級工程師高級工程師培養(yǎng)單位化學與環(huán)境工程學院培養(yǎng)單位化學與環(huán)境工程學院二○一五○一五年五月分類號分類號X7035X7035學校代號學校代號1049010490學號201303035201303035武漢工程大學碩士學位論文啤酒污泥生物營養(yǎng)劑的制備及工程化啤酒污泥生物營養(yǎng)劑的制備及工程化應用研究應用研究作者姓名劉政指導教師姓名、職稱明銀安副教授校外導師姓名、職稱楊文斌高工申請學位類別工程碩士學科專業(yè)名稱環(huán)境工程研究方向水污染控制論文提交日期20153論文答辯日期2015528學位授予單位武漢工程大學學位授予日期年月日答辯委員會主席張彩香