重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)的畢赤酵母工程菌構(gòu)建、表達(dá)、分離純化及其生物學(xué)作用研究.pdf

1、人生長(zhǎng)激素(human Growth Hormone，hGH)對(duì)人體的生長(zhǎng)和發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，生長(zhǎng)激素的缺乏會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)障礙等疾病的發(fā)生，含hGH類藥物可治療上述疾病。目前，臨床應(yīng)用的hGH主要通過DNA重組技術(shù)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)獲得。酵母屬于真核生物，在真核蛋白表達(dá)和分離純化工藝方面比大腸桿菌更有優(yōu)勢(shì)。本文選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過構(gòu)建高效表達(dá)的重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human Growth Horm

2、one，rhGH)工程菌、優(yōu)化表達(dá)條件、研究分離純化工藝，并初步測(cè)定其生物學(xué)作用。
　　本文對(duì)hGH的cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，并進(jìn)行人工合成，采用3種質(zhì)粒(pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A)作為目的基因的表達(dá)載體，通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至3種畢赤酵母(X-33、GS115、SMD1168)中進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)不同載體-宿主組合的表達(dá)量差異進(jìn)行比較。采用表達(dá)量最高的組合(X-33和pPICZα-A組合，簡(jiǎn)稱X-Zα)進(jìn)

3、行了1L搖瓶和3L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對(duì)其分離純化工藝進(jìn)行研究，最后在體外對(duì)rhGH的生物學(xué)作用進(jìn)行初步測(cè)定。研究結(jié)果包括:
　　1.研究不同載體-宿主組合對(duì)rhGH表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，在X-33與pPICZα-A組合時(shí)rhGH表達(dá)量達(dá)到最高。
　　2.對(duì)1L和3L規(guī)模的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在1L搖瓶規(guī)模時(shí)，最佳誘導(dǎo)溫度和pH為23℃和pH6.0;在23℃、pH6.0進(jìn)行3L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，當(dāng)采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(

4、Basal Salts Medium，BSM)時(shí)表達(dá)量最高為300.0 mg/L左右，較大腸桿菌表達(dá)rhGH的量高。
　　3.對(duì)rhGH分離純化工藝進(jìn)行研究，最終經(jīng)高速冷凍離心、雙水相、超濾以及離子交換層析處理后，獲得了收率大于60％，純度高于90％的rhGH。
　　4.對(duì)獲得的rhGH初步進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定，結(jié)果表明，rhGH對(duì)人正常肝細(xì)胞QSG-7701和人肝癌細(xì)胞Bel-7402的生長(zhǎng)和增殖具有促進(jìn)作用。
　　本