重組人溶菌酶酵母工程菌的構建和活性干粉制備.pdf

1、溶菌酶是一種能水解致病菌細胞壁的堿性蛋白質(zhì)，具有抗菌消炎和增強免疫力等功效，在臨床和食品保鮮方面具有較大應用價值。已知的溶菌酶根據(jù)來源不同可分為三類:雞卵清溶菌酶（c型）、鵝卵清溶菌酶（g型）和噬菌體溶菌酶，其中人溶菌酶屬于c型，人溶菌酶編碼基因（hLYZ）全長891 bp，可編碼148個氨基酸，成熟肽由130個氨基酸殘基組成，相對分子量大小約為14.7 kD。本實驗從人胎盤組織中克隆了hLYZ基因，將其編碼區(qū)信號肽切除，成熟肽基因與畢

2、赤酵母分泌表達載體pPICZαA連接，構建重組分泌型表達載體pPICZαA-hLYZ，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，甲醇誘導表達48h，從上清液收集蛋白，SDS-PAGE測得目的蛋白表達且表達量占上清液總蛋白的20.4％，溶壁微球菌抑菌試驗測定抑菌圈直徑為1.423 cm，說明重組酵母成功表達有活性的溶菌酶。為了研究載體信號肽對蛋白表達的影響，通過定點突變技術將表達載體pPICZαA信號肽C端與hL YZ成熟蛋白質(zhì)N端相連的2個氨基酸Leu

3、和Glu分別突變成Pro和His，構建了1個新的突變表達載體，隨后進行甲醇誘導表達，經(jīng)Quantity One軟件對蛋白質(zhì)相對表達量分析發(fā)現(xiàn)，甲醇誘導72 h，野生型的相對表達量是31.2％，突變型的相對表達量是43.8％，約是野生型的表達量的1.4倍，且突變體的抑菌圈直徑為1.950 cm，也明顯大于野生型的抑菌圈直徑，說明改造該載體可促進目的蛋白的表達。
　　近年來，利用酵母表達系統(tǒng)分泌表達人溶菌酶的基因工程產(chǎn)品研究較多，而關

4、于酵母胞內(nèi)表達該酶卻鮮有報道。本研究旨在構建一種胞內(nèi)表達溶菌酶的新型酵母工程菌，利用其高蛋白、分泌溶菌酶的特點開發(fā)新型動物飼料添加劑，避免直接使用人溶菌酶制劑帶來的高成本、活性不穩(wěn)定等問題。研究方法是將自人胎盤提取的人溶菌酶編碼基因hLYZ克隆至表達載體pPICZA上，經(jīng)驗證后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，接種BMGY培養(yǎng)基在30℃條件下220rpm搖床培養(yǎng)12h，換至BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h添加甲醇至終濃度為1％進

5、行誘導表達，48 h后western blot測定蛋白表達且比濁法測定人溶菌酶活力為1920 U，SDS-PAGE未檢測到蛋白條帶，說明目的蛋白胞內(nèi)表達量不高，可能是和酵母自身密碼子偏好有關，且酵母細胞壁含有溶菌酶的最適作用底物，也可能影響到溶菌酶的表達量。
　　實驗室培養(yǎng)酵母所用培養(yǎng)基BMGY/BMMY成本較高，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為了尋求高效、廉價的培養(yǎng)基，本實驗將酵母培養(yǎng)基進行改良，已有報道利用豆粕玉米等培養(yǎng)酵母，但蛋

6、白利用率較低，本實驗選用麥芽汁和蠶蛹粉，為酵母生長提供所必需的碳源、氮源，酵母營養(yǎng)鹽可以提供酵母生長所必需的微量元素。通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件。單因素結(jié)果表明酵母培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為蠶蛹粉占比40％，酵母營養(yǎng)鹽含量為170 ug/mL。利用麥芽汁-蠶蛹粉基礎生長培養(yǎng)基/麥芽汁高溫浸提液培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細胞，正交實驗結(jié)果R值的順序為:生長階段pH＞誘導階段甲醇含量＞接種量;即最佳培養(yǎng)條件為生長階段pH為6.0，誘導階段