簡介：本研究以攜帶雞Α干擾素（CHIFN?。┖碗uΓ干擾素（CHIFNΓ）編碼基因的釀酒酵母重組工程菌株INVSC1PYEIFNR、INVSC1PYEIFNG為材料，經(jīng)鑒定分析和誘導(dǎo)重組干擾素蛋白表達(dá)后，通過真空冷凍干燥法制備活性酵母干粉，進(jìn)一步對其抗病毒活性、營養(yǎng)價值及毒理安全性進(jìn)行評價研究，為開發(fā)能夠用于禽病防治的高活性、營養(yǎng)豐富和安全的飼料微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下1釀酒酵母重組工程菌株的鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。分別通過菌落PCR、基因組PCR、SOUTHERNBLOT、SDSPAGE、ELISA和質(zhì)譜等技術(shù)，對實驗室構(gòu)建保種的CHIFNΑ、CHIFNΓ兩種重組釀酒酵母基因工程菌進(jìn)行鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，外源CHIFNΑ基因和CHIFN?；蛟贗NVSC1PYEIFNR和INVSC1PYEIFNG工程菌株中穩(wěn)定存在，并分別在宿主基因組中以1拷貝和2拷貝進(jìn)行插入；工程菌能有效表達(dá)和累積重組蛋白，RCHIFNΑ和RCHIFNΓ的分子量分別為401KDA和39KDA，最高表達(dá)量分別為4320NGL和4429NGL。2建立活性酵母干粉的真空冷凍干燥制備工藝。通過二水平因子試驗和響應(yīng)面分析法，對冷凍干燥保護劑、干燥時間及溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了高活性酵母干粉的真空冷凍干燥制備工藝發(fā)酵誘導(dǎo)16H→離心（4℃，5000RMIN，10MIN）收集菌泥→添加復(fù)合保護劑（1444G100ML蔗糖、1008G100ML脫脂奶粉和111G100ML聚乙二醇）→80℃預(yù)凍2H→低溫真空干燥8H（80℃、3～10PA）→刮粉粉碎。利用該工藝制備的酵母含水量為563％，成粉質(zhì)量好、復(fù)水后菌體形態(tài)正常，細(xì)胞存活率達(dá)8081。3重組工程菌的生物學(xué)活性鑒定。利用雛雞新城疫病毒（NDV）動物活體攻毒系統(tǒng)進(jìn)行CHIFNΑ、CHIFNΓ兩種釀酒酵母重組工程菌粉的抗病毒活性檢測。當(dāng)NDV病毒的HA效價增值到29、雛雞體內(nèi)母源抗體效價低于24時（15日齡）進(jìn)行攻毒。工程菌粉的日糧添加比例為03，喂養(yǎng)不同時間后，進(jìn)行NDV皮下注射攻毒。20D的試驗期結(jié)果表明，飼喂CHIFNΑ或CHIFNΓ釀酒酵母重組工程菌組NDV抗體效價高于對照組；CHIFNΑ和CHIFNΓ兩種釀酒酵母重組工程菌粉均對感染病毒的雛雞具有保護作用；當(dāng)同時添加兩種菌粉（添加比例為11，每日喂養(yǎng)量為03G羽）時保護效果最好，對雛雞的保護率可達(dá)71。口服喂養(yǎng)CHIFNΑ、CHIFNΓ兩種釀酒酵母重組工程菌粉可以提高雛雞的NDV病毒抗性。4重組工程菌粉的品質(zhì)和營養(yǎng)分析。根據(jù)國家飼料質(zhì)量檢測相關(guān)標(biāo)方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重組工程菌具有釀酒酵母的正常形態(tài)特征，感官質(zhì)量良好；CHIFNΑ、CHIFNΓ兩種釀酒酵母重組工程菌粉的含水量分別為56和54，復(fù)水后的活細(xì)胞數(shù)分別為266395億個G和267854億個G；其細(xì)菌總數(shù)、霉菌、沙門氏菌、鉛和總砷等微生物及重金屬含量均符合國標(biāo)衛(wèi)生學(xué)要求，營養(yǎng)成分檢測分析表明，CHIFNΑ工程菌粉的灰分、總糖、粗脂肪和粗纖維含量均高于野生型菌粉，其第一限制性氨基酸為苯丙氨酸酪氨酸；CHIFNΓ工程菌粉的灰分、總糖、總磷、總鈣、總必需氨基酸和總非必需氨基酸含量均高于野生型菌粉，其第一限制性氨基酸為苯丙氨酸酪氨酸。兩種釀酒酵母重組工程菌粉的賴氨酸、和甲硫氨酸2種必需氨基酸的含量均高于野生型菌粉，第一限制性氨基酸為苯丙氨酸酪氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸，該兩種工程菌粉的蛋白模式不符合蛋白質(zhì)飼料要求。5重組工程菌粉的毒理安全性評價。通過最大耐受量法的急性毒理試驗對CHIFN重組工程菌粉進(jìn)行安全性分析評價。結(jié)果表明CHIFNΑ、CHIFNΓ兩種釀酒酵母重組工程菌粉對三黃雞的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量均大于1333GKG體重，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，該兩種釀酒酵母重組菌粉屬于無毒。綜上所述，釀酒酵母CHIFN重組工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定特性，能有效表達(dá)RCHIFNΑ和RCHIFNΓ，CHIFNΑ和CHIFNΓ兩種工程菌均對NDV具有抑制作用，真空冷凍干燥制備的CHIFN重組工程菌粉具有較高的活性、較好的營養(yǎng)價值和安全性。本研究得到的CHIFNΑ和CHIFNΓ兩種釀酒酵母重組工程菌，具有作為天然、安全的飼料添加劑進(jìn)行禽病毒病防治的良好研發(fā)前景。

簡介：目的模擬椎間盤組織結(jié)構(gòu)和功能，構(gòu)建具有生物學(xué)活性的組織工程椎間盤，初步評價其在體內(nèi)的生物學(xué)功能。方法⑴取3周齡新西蘭大白兔椎間盤組織，利用Ⅱ型膠原酶消化法分別獲取髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，觀察鑒定第二代P2細(xì)胞。⑵利用交聯(lián)反應(yīng)制備的殼聚糖水凝膠作為髓核支架，利用靜電紡絲技術(shù)制備的聚對苯二甲酸共丁二酸丁二醇酯POLYBUTYLENESUCCINATECOTEREPHTHALATE，PBST紡絲薄膜作為內(nèi)纖維環(huán)支架，以實心的PBST環(huán)作為外纖維環(huán)支架。采用掃描電鏡表征殼聚糖水凝膠和PBST紡絲薄膜的空間結(jié)構(gòu)，測試PBST紡絲薄膜的孔隙率及吸水率。⑶在殼聚糖水凝膠、PBST紡絲薄膜上分別接種髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，培養(yǎng)3W后，HE染色檢測支架的細(xì)胞相容性。⑷以殼聚糖水凝膠作為髓核支架，PBST紡絲薄膜作為內(nèi)纖維環(huán)支架，實心的PBST環(huán)作為外纖維環(huán)支架，組裝成PBST殼聚糖水凝膠三相組織工程椎間盤支架，檢測三相組織工程椎間盤支架的力學(xué)性能。⑸將P2代纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞分別接種在纖維環(huán)、髓核支架上，再移至裸鼠皮下培養(yǎng)4W后，通過HE、番紅O、COLLAGENⅡ免疫組化、AGGRECAN免疫熒光染色觀察組織工程椎間盤的形態(tài)結(jié)構(gòu)和Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)。⑹用上述裸鼠皮下培養(yǎng)的組織工程椎間盤置換3月齡新西蘭大白兔的椎間盤，鋼板固定相鄰椎體。術(shù)后4W行X線、MRI檢測并獲取組織工程椎間盤標(biāo)本，通過HE、番紅O、COLLAGENⅡ免疫組化、AGGRECAN免疫熒光染色觀察組織工程椎間盤的形態(tài)結(jié)構(gòu)和Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)。⑺提取裸鼠皮下組織工程椎間盤（裸鼠組）、實驗兔體內(nèi)組織工程椎間盤（實驗兔組）、兔正常椎間盤（對照組）的RNA，體外擴增COLLAGENⅡ、AGGRECAN基因，RTPCR檢測Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達(dá)。結(jié)果①體外培養(yǎng)的P2代纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞在形態(tài)上呈長梭形或多邊形，生長速度快。兩種細(xì)胞的番紅O、COLLAGENⅡ免疫組化、AGGRECAN蛋白聚糖免疫熒光染色均呈陽性，表明細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原、蛋白聚糖。②殼聚糖水凝膠呈白色海綿狀，吸水后呈透明膠凍狀，掃描電鏡見支架存在大量孔隙，孔隙之間相互連通。接種髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)3W后，HE染色可見細(xì)胞在支架內(nèi)生長良好，細(xì)胞分布均勻。③光鏡下見PBST纖維粗細(xì)均勻，無珠狀體形成PBST紡絲薄膜呈白色，較疏松，孔隙率為6183％±733％，吸水率為29734％±5713％復(fù)合纖維環(huán)細(xì)胞體外培養(yǎng)3W后的PBST紡絲薄膜HE染色可見纖維環(huán)細(xì)胞在PBST紡絲薄膜內(nèi)分布均勻，細(xì)胞大量增殖。④組裝的三相組織工程椎間盤支架大小約952MM，各相之間連接緊密，無明顯縫隙壓縮強度為310MPA±013MPA，彈性模量為2222MPA±092MPA拉伸強度為321MPA±018MPA，彈性模量為1813MPA±130MPA。⑤裸鼠皮下構(gòu)建的組織工程椎間盤具有與正常椎間盤相似的結(jié)構(gòu)，各相之間融合良好，種子細(xì)胞在組織工程椎間盤內(nèi)分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。⑥X線檢測見鋼板內(nèi)固定位置良好，無斷裂、移位，椎間隙高度正常MRI檢測見組織工程椎間盤T2相為高信號。⑦術(shù)后4W解剖實驗兔，組織工程椎間盤在椎間隙位置良好，形態(tài)完整，無移位、碎裂組織工程椎間盤的HE染色見大量細(xì)胞，番紅O、COLLAGENⅡ免疫組化、AGGRECAN免疫熒光染色陽性，表明組織工程椎間盤含有Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。⑧RTPCRCOLLAGENⅡMRNA的表達(dá)對照組高于實驗兔組，P0001，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義對照組高于裸鼠組，P0000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。AGGRECANMRNA的表達(dá)對照組高于實驗兔組，P0000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義對照組高于裸鼠組，P0000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義裸鼠組高于實驗兔組，P0000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論⑴PBST殼聚糖三相組織工程椎間盤支架材料符合正常椎間盤的結(jié)構(gòu)特點，具有良好的細(xì)胞相容性、孔隙率、力學(xué)性能和可塑性。⑵在裸鼠皮下構(gòu)建的組織工程椎間盤各相之間融合良好，形態(tài)學(xué)觀察、組織結(jié)構(gòu)特點與正常椎間盤相似，具有細(xì)胞生物活性。⑶采用鋼板固定相鄰上下椎體的固定方式可靠。組織工程椎間盤在體內(nèi)繼續(xù)保持細(xì)胞活性，分泌椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)，部分發(fā)揮椎間盤的生物學(xué)功能。⑷本實驗可為組織工程椎間盤構(gòu)建提供理論依據(jù)。

簡介：目的本實驗采用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法SOW制備載辛伐他汀的聚乳酸羥基乙酸共聚物PLGA微球，測量載辛伐他汀PLGA微球的粒徑大小和分布、載藥率和藥物釋放的規(guī)律然后，將微球與磷酸鈣骨水泥CPC復(fù)合構(gòu)建載辛伐他汀PLGA磷酸鈣骨水泥組織工程骨，首先對其進(jìn)行孔徑大小和分布、孔隙率和抗壓性能等材料學(xué)性質(zhì)的研究其次，體外提取、純化、培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCS，觀察該組織工程骨對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)成骨分化的能力，評估其體外生物相容性和成骨分化活性最后，麻醉后手術(shù)構(gòu)建兔股骨髁骨缺損的模型，將載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨植入股骨髁外側(cè)骨缺損部位，通過影像學(xué)MICROCT和組織學(xué)（HE染色）觀察其動物體內(nèi)生物相容性和成骨活性。本項研究的目的足制備載辛伐他汀的PLGA載藥微球，并將其與磷酸鈣骨水泥復(fù)合后構(gòu)建組織工程骨，測定其材料學(xué)性質(zhì)，評價其體外和動物體內(nèi)生物相容性和成骨活性，探討其對兔股骨髁骨缺損的修復(fù)效果。本實驗的創(chuàng)新點在于首次采用PLGA微球作為緩釋載體，成功構(gòu)建了可緩釋辛伐他汀的組織工程骨，有望為骨缺損的修復(fù)治療提供一種新途徑。本項研究分為三部分1載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的制備和材料學(xué)性質(zhì)研究2載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和成骨分化活性的體外研究3載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和促進(jìn)兔股骨髁骨缺損愈合的動物體內(nèi)研究?，F(xiàn)將本實驗的主要內(nèi)容介紹如下。第一部分載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的制備和材料學(xué)性質(zhì)研究方法運用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法SOW制備單純PLGA微球、搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球。通過掃描電鏡SEM觀察單純PLGA微球、搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球的微觀形態(tài)，測量微球粒徑的大小和分布將搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球置于緩沖溶液中，通過酶標(biāo)儀測定其載藥和緩釋性能。分別將單純PLGA微球、搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球與磷酸鈣骨水泥混合、固化制備出單純PLGA磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨。通過掃描電鏡SEM觀察單純PLGA磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的微觀結(jié)構(gòu)通過MICROCT掃描檢測兩種組織工程骨的孔徑大小、分布以及孔隙率采用萬用測試儀檢測兩種組織工程骨的抗壓強度即力學(xué)性能。結(jié)果運用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法SOW成功制備出粒徑約22189±7020ΜM的單純PLGA微球和粒徑約21795±6337ΜM的載辛伐他汀的PLGA載藥微球，兩種微球的外觀、粒徑大小和分布無顯著差異。載辛伐他汀PLGA微球的載藥率為8530±43％，在前7天可緩釋約60％的藥量，并可緩慢釋放辛伐他汀約21天。單純PLGA磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨均具有良好的三維孔隙結(jié)構(gòu)。單純PLGA磷酸鈣組織工程骨的孔隙率約為6450±427％，孔徑約為23465±6536ΜM，抗壓強度約為634±141MP載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的孔隙率約為6595±330％，孔徑約為22574±5702ΜM，抗壓強度約為652±173MP。兩種組織工程骨的孑L隙率、孔徑和抗壓強度無顯著差異。結(jié)論1運用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法SOW可成功制備出符合材料學(xué)要求的載藥PLGA微球。2PLGA微球可作為辛伐他汀的載體和緩釋體。隨著載藥微球的降解，可使辛伐他汀產(chǎn)生突釋效應(yīng)且緩慢釋放達(dá)21天。3載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨具有優(yōu)異的藥物緩釋性能、良好的三維連通性、合適的孔隙孔徑結(jié)構(gòu)和抗壓性能。第二部分載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和成骨分化活性的體外研究方法過量麻醉后取1月齡新西蘭大白兔的股骨和脛骨，F(xiàn)ICOLL密度梯度離心法提取原代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)、傳代，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。流式細(xì)胞儀鑒定后，將生長狀態(tài)良好的第四代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種于單純PLGA磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨。培養(yǎng)7天后，運用掃描電鏡觀察接種細(xì)胞的形態(tài)運用CCK8活細(xì)胞計數(shù)法檢測接種細(xì)胞的黏附和增殖情況運用流式細(xì)胞周期檢測組織工程骨對于接種細(xì)胞的周期影響對接種細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性測定和茜素紅S染色以評估組織工程骨的成骨分化活性。結(jié)果單純PLGA磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨均對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著良好的生物相容性，而后者表現(xiàn)出更強的成骨分化活性。兩種組織工程骨均與細(xì)胞粘附性良好，接種于載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的細(xì)胞形態(tài)呈多角狀，且細(xì)胞的數(shù)量更多。相對于單純PLGA磷酸鈣組織工程骨組和空白對照組，載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨組的細(xì)胞增殖、處于細(xì)胞分裂期的細(xì)胞數(shù)、堿性磷酸酶活性以及茜素紅S染色陽性的礦化結(jié)節(jié)數(shù)日和范圍均明顯增高P＜005。結(jié)論FICOLL密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可分離、培養(yǎng)出純度較高的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。體外細(xì)胞實驗顯示載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨具有良好的生物相容性和成骨分化活性，其緩釋的辛伐他汀可促進(jìn)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其成骨分化。第三部分載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和促進(jìn)兔股骨髁骨缺損愈合的動物體內(nèi)研究方法建立新西蘭大白兔單側(cè)股骨髁骨缺損模型30只（6周齡，雌雄各半，體重約10KG山東大學(xué)實驗動物中心提供，許可編號SYXK20130001），按照隨機原則分為A、B、C三組，每組10只。A組為空白對照組，即假手術(shù)組，僅建立股骨髁骨缺損B組為單純PLGA磷酸鈣組織工程骨組，將單純PLGA磷酸鈣組織工程骨植入骨缺損部位C組載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨組，將載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨植入骨缺損部位。于術(shù)后6、12周時通過大體觀察、MICROCT掃描（二維掃描分析和三維重建）和病理組織切片觀察，評估骨缺損的愈合情況，并分析各組骨缺損的愈合程度有無顯著差異。結(jié)果植入組織工程骨后6周和12周時，載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨組的骨缺損修復(fù)的速度和質(zhì)量均顯著優(yōu)于空白對照組和單純PLGA磷酸鈣組織工程骨組。標(biāo)本大體觀察術(shù)后6周和12周時，C組骨缺損的愈合情況均要優(yōu)于A組和B組。MICROCT掃描分析C組骨覆蓋率BONECOVERAGE于6周和12周時分別為2578±689％和6806±1162％，骨密度值（BONEMINERALDENSITY）于6周和12周時分別為9092±985MGCM3和20198±1223MGCM3，顯著優(yōu)于A組（骨覆蓋率6周時340±225％，12周時610±448％骨密度值6周時3104±575MGCM3，12周時5280±884MGCM3）和B組（骨覆蓋率6周時1289±575％，12周時2924±925％骨密度值6周時5928±575MGCM3，12周時5208±1078MGCM3）。MICROCT三維重建C組股骨髁骨缺損愈合的速度和質(zhì)量均顯著高于A組和B組，12周時骨缺損處已經(jīng)完全愈合，和周圍骨組織無明顯界限。A組骨缺損處未見明顯愈合，12周時仍有大塊缺損B組骨缺損處見部分愈合，12周時仍然遺留部分缺損。組織學(xué)檢查（HE染色）C組骨小梁及骨基質(zhì)的形成速度和質(zhì)量均優(yōu)于A組和B組，可見大量新骨生成，骨小梁的厚度與正常骨組織近似。A組骨缺損處少見新生骨小梁，由大量的纖維細(xì)胞填充。B組骨缺損處可見部分新生較纖細(xì)的骨小梁和少量的纖維細(xì)胞填充。結(jié)論動物體內(nèi)實驗顯示載辛伐他汀PLGA磷酸鈣組織工程骨具有良好的生物相容性和促進(jìn)成骨作用，可提高骨缺損修復(fù)的速度和質(zhì)量。

簡介：我國的資產(chǎn)評估行業(yè)誕生于20世紀(jì)80年代末。隨著改革開放的穩(wěn)定發(fā)展，資產(chǎn)評估作為中介行業(yè)中專業(yè)化、高端化領(lǐng)域的一部分，對我國的經(jīng)濟有序進(jìn)行等諸多方面都起著關(guān)鍵性的作用，已經(jīng)發(fā)展成為了我國市場經(jīng)濟運行過程中不可或缺的重要力量1。但是因為資產(chǎn)評估行業(yè)在我國起步較晚，早期在法律法規(guī)方面和監(jiān)管層面都相對不健全，在近些年的評估業(yè)務(wù)中也出現(xiàn)了較多的追溯性評估案例。但是在追溯性評估工作領(lǐng)域的系統(tǒng)性可參考案例不多，相關(guān)的研究工作也并不是很充分。在追溯性評估工作的探討中，是以成本法為主要方法。但針對收益相對可觀的企業(yè)，成本法并不能夠充分地體現(xiàn)其真正價值。本文針對這一問題，通過以青島A生物工程有限公司的追溯性評估為主導(dǎo)，分析探討收益法在追溯性評估中的應(yīng)用。首先，本文針對國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，分析了將收益法應(yīng)用在追溯性評估中的研究背景及意義，總結(jié)了在成本法不能全面地考慮企業(yè)真實收益的情況下，應(yīng)用收益法的必要性。并歸納了國內(nèi)外有關(guān)收益法及追溯性評估的研究文獻(xiàn)，進(jìn)而得出了學(xué)術(shù)界研究收益法和追溯性評估的結(jié)論與特點。其次，在綜合學(xué)者的研究和學(xué)習(xí)下，系統(tǒng)地闡述了收益法以及追溯性評估相關(guān)理論，探討了關(guān)于收益法中三個基本參數(shù)，即收益額、折現(xiàn)率和收益期的確定方法及所需要注意的事項。然后，結(jié)合上述理論的研究，在充分了解青島A生物工程有限公司的企業(yè)概況的基礎(chǔ)上，對評估基準(zhǔn)日下的宏觀經(jīng)濟、行業(yè)狀況等進(jìn)行分析。運用收益法對青島A生物工程有限公司進(jìn)行了完整的追溯性評估，結(jié)果為青島A生物工程有限公司股東全部權(quán)益的評估值為人民幣1，57716萬元。最后，本文對評估青島A生物工程有限公司股東全部權(quán)益價值的過程及結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)，肯定了收益法應(yīng)用于追溯性評估中的合理性，也提出了收益法在追溯性評估中的難點及改善方案。在工作層面的主要難點有兩個方面，一方面追溯性評估前期分析資料不健全，易受到實際數(shù)據(jù)影響，達(dá)不到真正的“預(yù)測”另一方面，追溯性評估工作中缺乏獨立環(huán)境，評估工作相比于現(xiàn)時評估更容易依賴企業(yè)方面。在技術(shù)層面的主要難點分別是與收益預(yù)測相關(guān)和與參數(shù)相關(guān)的難點。為在追溯性評估中更加準(zhǔn)確合理地應(yīng)用收益法，針對工作的難點給出了四條研究性的建議，分別是加強收益法深層次研究及創(chuàng)新、提升評估人員專業(yè)綜合素質(zhì)、完善企業(yè)資產(chǎn)評估的相關(guān)指標(biāo)和資產(chǎn)評估行業(yè)各項工作向標(biāo)準(zhǔn)化靠攏。

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簡介：目的新型有序納米介孔生物玻璃80SMESOPOUSBIOACTIVEGLASSES80S，MBG80S，以下簡稱MBG是復(fù)旦大學(xué)嚴(yán)曉霞等通過采用溶劑揮發(fā)誘導(dǎo)自組裝并結(jié)合溶膠凝膠技術(shù)制備的一類新型材料。初步研究表明，其具有良好的體外生物活性和生物相容性。本文研究新型有序納米介孔生物活性玻璃在體外模擬實驗中的力學(xué)性能變化及其機制，對骨形成蛋白2BMP2的吸附和緩釋效應(yīng)及其機制和對成骨細(xì)胞增殖，分化，礦化以及粘附的作用，以探討其進(jìn)一步發(fā)展為骨組織工程支架材料的可能性。方法第一部分實驗中，將MBG80S粉劑壓制成型后，浸泡于SBF液中，10天中于各時間點取出后取一枚掃描電鏡觀察表面和內(nèi)部的變化，其余測試彈性模量和壓縮強度，并測定濾液中的離子濃度和PH變化。并以具有相同化學(xué)組分無介孔結(jié)構(gòu)的生物玻璃80SBG80S，以下簡稱BG為對照組平行測試。第二部分實驗中，我們利用與RHBMP2有近似結(jié)構(gòu)、等電點和分子量的A糜蛋白酶ACHY為模擬蛋白，用I125同位素標(biāo)記作為示蹤，研究了MBG單體粉劑的吸附曲線，MBG成型片劑的吸附曲線和MBG80S片劑兩周的短期釋放曲線。同樣以BG為對照，分析其吸附和釋放機制。最后我們用I125同位素標(biāo)記RHBMP2，描記MBG成型片劑三個月的釋放曲線，總結(jié)藥代動力學(xué)規(guī)律。第三部分實驗中，用混合酶消化法分離大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)；成骨細(xì)胞與不同濃度的MBG浸提液作用后，以空白培養(yǎng)液為對照，MTT法測定細(xì)胞增殖；PNPP法檢測堿性磷酸酶活性；礦化結(jié)節(jié)計數(shù)和面積測量分析MBG對成骨細(xì)胞礦化能力的影響。并測定MBG浸提液和空白培養(yǎng)液中的離子濃度。同時用00625％濃度的MBG浸提液配制不同濃度的RHBMP2MBG培養(yǎng)液，以空白培養(yǎng)液和不同濃度的RHBMP2培養(yǎng)液為對照，MTT法測定細(xì)胞增殖；PNPP法檢測堿性磷酸酶活性。第四部分實驗中用混合酶消化法分離大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)；將細(xì)胞接種于MBG片劑上，培養(yǎng)3D，7D，11D，掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)和粘附情況。結(jié)果1電鏡下MBG材料表面和內(nèi)部在4小時以后就有含碳羥基磷灰石HCA的生長，材料顆粒間縫隙的數(shù)量和尺寸都明顯減小，顆粒間相互融合。而BG80S材料表面和內(nèi)部無明顯晶體生長。力學(xué)測試表明初始強度相同的MBG80S和BG80S材料，在SBF液中浸泡4小時后力學(xué)性能發(fā)生了完全不同的變化，前者的彈性模量快速上升100150MPA，48小時后維持于250200MPA，壓縮強度基本同步，在2030MPA和3040MPA之間。而BG快速下降，彈性模量和壓縮強度分別維持在20MPA左右和10MPA以下。離子濃度和PH變化，MBG和BG材料之間，MBG材料與粉劑之間也有明顯的不同。提示MBG的快速表面晶體生長是改變材料力學(xué)性能的主要原因，同時也改變了材料內(nèi)外的物質(zhì)交流。2MBG和BG粉劑本身蛋白快速吸附在4小時時達(dá)到最大，分別為47080UGMG和19912UGMG蛋白材料，此后隨著MBG表面HCA晶體生長，其蛋白吸附仍有進(jìn)一步增長，而BG則沒有明顯變化。壓片后，MBG和BG材料的最大吸附量和吸附曲線形態(tài)較粉劑都有較大的變化，由于HCA晶體生長改變了材料內(nèi)外的物質(zhì)交流，MBG改變更大。在模擬蛋白ACHY的短期釋放實驗中，MBG和BG都有緩釋作用，但MBG緩釋更為平緩。在對RHBMP2的釋放實驗中，MBG表現(xiàn)出良好的緩釋性能，其釋放行為符合HUGICHI方程，MBG對RHBMP2的50％緩釋時間為24838天。305％以下各濃度組MBG浸提液均對成骨細(xì)胞增殖無影響，而1％濃度組對細(xì)胞增殖有輕度抑制，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著意義；各濃度MBG浸提液均可以增強堿性磷酸酶活性，與對照組相比，其中00625、0125、025％濃度明顯提高ALP活性，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義；00625％濃度時，礦化結(jié)節(jié)數(shù)目無明顯變化，而礦化結(jié)節(jié)面積則明顯增加。提示MBG在低濃度時對成骨細(xì)胞由較好的促進(jìn)分化和礦化作用，對增殖無明顯作用。用00625％濃度的MBG浸提液配制不同濃度的RHBMP2MBG培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細(xì)胞后，與空白培養(yǎng)液相比各濃度組RHBMP2MBG培養(yǎng)液對細(xì)胞增殖和分化無明顯作用，但相同蛋白濃度的RHBMP2MBG培養(yǎng)液和RHBMP2細(xì)胞培養(yǎng)液相比有明顯差異，提示RHBMP2與MBG浸提液中的產(chǎn)物可能在分子生物學(xué)水平上有某種相互影響的作用。4掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài)分化良好，胞體伸長呈長梭形、多邊形或異型形，細(xì)胞表面具有較多的皺褶和微絨毛，眾多絲狀和纖維狀突起伸展相互聯(lián)接形成網(wǎng)狀。成骨細(xì)胞在材料表面粘附良好，細(xì)胞相互之間結(jié)合良好。提示MBG對成骨細(xì)胞有良好的生物相容性和粘附性能。結(jié)論新型有序納米介孔生物玻璃80SMBG80S在體外試驗中，具有良好的力學(xué)性能，對中低分子有良好的吸附和緩釋作用，對成骨細(xì)胞有良好的生物相容性和細(xì)胞粘附性能，有希望成為新型的骨組織工程支架材料和骨缺損填充材料，值得進(jìn)一步深入研究。

簡介：目的隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，組織工程骨的出現(xiàn)為大段骨缺損修復(fù)帶來新的希望。然而，血管化問題仍是制約組織工程骨應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵因素。支架材料作為骨組織工程的三大要素之一，對組織工程骨體內(nèi)快速血管化和新骨形成起著重要作用。因此，本研究擬制備新型促血管化支架材料并評價其體內(nèi)外生物學(xué)性能。方法1新型促血管化支架材料制備及表征①首先以可溶性鈣鹽、銅鹽、鋅鹽、磷鹽為原料，采用化學(xué)沉淀法制備缺鈣磷灰石粉體。將粉體制成漿料，以海藻酸鈣為造孔劑，經(jīng)高溫煅燒，得到摻雜銅鋅離子的雙相磷酸鈣多孔支架。根據(jù)離子摻雜含量不同CUCUZNCA摩爾比分別為0，0005，002，005，CUZN摩爾比1∶1），將得到產(chǎn)物分別定義為P0、P1、P2和P3。采用掃描電鏡SEM、X射線衍射儀XRD、紅外光譜儀FTIR、X射線光電子能譜分析儀XPS對支架形貌、晶相組成及化學(xué)成分進(jìn)行表征，萬能力學(xué)試驗機測定其強度，電感耦合等離子光譜發(fā)生儀ICP檢測鈣、銅、鋅離子釋放情況。②通過乳化法合成載GDF5蛋白的PLGA微球，真空負(fù)壓法將微球與支架P2復(fù)合，獲得載GDF5的多孔支架定義為P2GDF5。采用SEM對微球形貌及其在支架上的分布進(jìn)行觀察采用BCA蛋白測定法測定GDF5的釋放曲線。2新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評價①將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSC和內(nèi)皮細(xì)胞EC1∶1混合后與支架共培養(yǎng)，SEM和細(xì)胞核熒光染色（DAPI）觀察細(xì)胞在支架上生長情況，CCK8法檢測細(xì)胞增殖，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測ALP活性，熒光定量PCR檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)水平，ELISA法檢測VEGF分泌水平②制備材料浸提液，分別添加等濃度CU2、ZN2的培養(yǎng)基為對照組，并與細(xì)胞共培養(yǎng)。采用上述方法檢測細(xì)胞增殖和ALP活性茜素紅染色觀察BMSC成骨和礦化MATRIGEL測定EC成血管能力。3新型促血管化支架材料體內(nèi)生物學(xué)性能評價首先構(gòu)建兔橈骨15MM缺損模型，實驗分為五組K組不植入任何材料D組植入P0S1組植入P1S2組植入P2S3組植入P2GDF5。術(shù)后4、8、12周行X線影像學(xué)檢查，術(shù)后12周處死后，標(biāo)本包埋、切片后行HE、MASSON染色。結(jié)果1新型促血管化支架材料表征①SEM顯示支架孔徑約600～800ΜM，孔隙貫通，且隨著金屬離子含量的增加，支架表面由平滑、點狀顆粒、塊狀顆粒逐漸變化。XRD、FTIR和X射XPS分析顯示P0、P1和P2主要由HA和ΒTCP組成，其中P2組HATCP為3070，而P3主要為ΒTCP?？箟簭姸葴y試表明隨著離子濃度由0％增加到5％，支架抗壓強度由151MPA小幅度降至091MPA。離子體外釋放顯示，銅、鋅離子釋放量隨添加量的增加而增加，同時鈣離子釋放速度也隨之加快。②SEM見GDF5PLGA微球呈球形，表面光滑，粒徑主要分布在820ΜM之間微球均勻分布在支架的孔壁上，無明顯團聚。體外釋放示單純微球和微球在支架材料上，兩者GDF5釋放曲線相似，均實現(xiàn)平穩(wěn)釋放。2新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評價①支架材料均無明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞能較好地粘附、生長，P2GDF5支架上的細(xì)胞最多，P2次之CCK8檢測也顯示各組細(xì)胞增值良好，且P2GDF5組細(xì)胞增值明顯優(yōu)于其余三組P＜001。ALP檢測表明第14天時，P2GDF5組ALP表達(dá)水平最高，P2組次之。PCR分析顯示P2GDF5組細(xì)胞的ALP、OCN、OPN基因表達(dá)水平較其他各組明顯上調(diào)P＜005P2組細(xì)胞ALP、OCN、OSX表達(dá)水平較P0組高P＜0001。VEGF分泌量檢測示各組間均有差異P＜005，且P2GDF5組分泌水平最高。②浸提液結(jié)果表明浸提液組中細(xì)胞增殖速度最快，且ZN2組及浸提液組ALP活性明顯高于CU2組和空白組P＜001MATRIGEL成血管測試顯示CU2組和浸提液組內(nèi)皮細(xì)胞12H內(nèi)形成管腔樣結(jié)構(gòu)，而ZN2組和空白組細(xì)胞呈簇狀分布，未見管腔樣結(jié)構(gòu)形成培養(yǎng)21天后茜素紅染色顯示，ZN2組和浸提液組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積明顯多于空白組和銅離子組。3新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評價術(shù)后動物無死亡，所有動物術(shù)后能正常進(jìn)食及活動。術(shù)后4周，X線影像學(xué)顯示所有組支架材料清晰可見，無脫落、移位，骨缺損間隙明顯，僅S3組兩端可見少量低密度骨痂與材料連接術(shù)后8周，支架材料部分降解，且S1、S2和S3組材料降解量大于D組，K組和D組中新生硬化骨封閉髓腔口，斷端間暫無明顯骨性連接，S1、S2和S3均可見斷端部分骨性連接，骨性連接面積S3＞S2＞S1術(shù)后12周，K組斷端仍封閉，D組靠近尺骨側(cè)可見少量骨性連接，S1、S2、S3組骨缺損基本愈合，骨皮質(zhì)連續(xù)，部分髓腔實現(xiàn)貫通，S3修復(fù)速率明顯優(yōu)于其余各組。LANESHUX線評分結(jié)果表明，各時間點S3組評分最高，S2次之，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。組織學(xué)檢測表明所有支架植入部位均未出現(xiàn)明顯炎癥、毒性和免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后12周HE及MASSON染色顯示S1、S2、S3組均可見大量新生骨形成，S3組髓腔塑性較好，且新生血管數(shù)量明顯多于S1和S2組，D組可見部分類骨樣組織沿孔壁生長，K組缺損部位為大量纖維樣組織定量統(tǒng)計分析顯示S3組新生骨面積和血管數(shù)量多于各組P＜001。結(jié)論以海藻酸鈣為造孔劑，以PLGA微球為載體，成功制備了具有GDF5緩釋功能的銅鋅離子共摻雜雙相磷酸鈣多孔支架。該支架具有良好的細(xì)胞相容性、成骨誘導(dǎo)性和促血管化，且能快速修復(fù)大段骨缺損，是一種具有良好臨床應(yīng)用前景的骨修復(fù)支架材料。

簡介：山西大學(xué)2013屆碩士學(xué)位論文生物工程改良大白菜的抗旱性研究作者姓名指導(dǎo)教師學(xué)科專業(yè)研究方向培養(yǎng)單位學(xué)習(xí)年限羅雅楠裴雁曦教授郭尚副研究員生物工程植物基因工程生命科學(xué)學(xué)院2011年9月至2013年6月二。一三年六月目錄中文摘要IABSTRACTII第一章綜述111硫化氫在植物中生理功能的研究進(jìn)展1111內(nèi)源硫化氫的產(chǎn)生和清除1112硫化氫參與調(diào)控的生理過程212植物抗旱性的研究進(jìn)展5121干旱脅迫對植物生長發(fā)育的危害5122提高植物抗旱性的途徑713白菜類蔬菜轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀9131抗蟲基因9132抗病基因10133抗除草劑基因10134雄性不育基因1014白菜類蔬菜離體培養(yǎng)的影響因素1L141基因型11142外植體L1143AGN0312144植物激素組成12145NH4濃度12146瓊脂濃度13147抗壞血酸ASA1315根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)白菜類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀13151抑菌劑與篩選標(biāo)記13152基因型和外植體類型14153農(nóng)桿菌菌株14154菌液培養(yǎng)溫度14155農(nóng)桿菌侵染能力1416本課題研究的目的和意義15

簡介：有限元方法自上世紀(jì)中期誕生以來由于其通用性和有效性在包括生物醫(yī)學(xué)工程在內(nèi)的工程領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用和長足的發(fā)展。大型通用有限元應(yīng)用程序因其強大的功能、簡單的操作、可靠的結(jié)果和較高的效率更使有限元方法成為生物醫(yī)學(xué)工程中強有力的工具。本文通過利用有限元方法分析人體小腿的二維傳熱模型以及基于實際醫(yī)學(xué)影像的顱內(nèi)動脈瘤三維血液動力學(xué)模型對有限元方法在生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用進(jìn)行具體的介紹。本文首先對生物組織的主要傳熱方式、常用傳熱模型及熱物性參數(shù)測量方法進(jìn)行了簡要介紹。隨后根據(jù)人體小腿的截面解剖圖建立了簡化的二維傳熱模型將其劃分為骨骼層、內(nèi)部肌肉層、外部肌肉層及皮膚層等在熱量傳輸方面有重要區(qū)別的層次。我們計算并分析了血液灌注率、組織的代謝產(chǎn)熱率、環(huán)境溫度及空氣對流系數(shù)等因素對傳熱模型的影響。計算結(jié)果顯示代謝產(chǎn)熱率和空氣對流系數(shù)對組織溫度分布的影響相對較小而當(dāng)血液灌注率和環(huán)境溫度上升到一定程度時對組織溫度分布的影響也逐漸變小。我們還計算了幾種不考慮平行逆流血管對效應(yīng)的情況以考察其對組織溫度分布的影響對比結(jié)果顯示平行逆流血管對在人體組織傳熱過程中有著重要的作用。我們還從兩例顱內(nèi)動脈瘤患者的原始3DRA影像數(shù)據(jù)入手對顱內(nèi)動脈瘤的幾何外形進(jìn)行了精確的三維重建以此建立了在血液為牛頓流體和血管壁為剛性壁的假設(shè)前提下的血液動力學(xué)模型。計算結(jié)果顯示瘤頸處存在壁面切應(yīng)力最大點這是由于血液對瘤頸處的動脈管壁造成強烈沖擊瘤頸處的流場比較復(fù)雜血流速度梯度相對較大的緣故。我們還發(fā)現(xiàn)盡管載瘤動脈壁面切應(yīng)力變化較大動脈瘤本體內(nèi)壁面切應(yīng)力卻幾乎沒有變化并且其數(shù)值也很小。瘤頸處的高壁面切應(yīng)力和瘤體內(nèi)部的低壁面切應(yīng)力正是促使動脈瘤形成、生長乃至破裂的重要因素。計算結(jié)果對臨床上診斷和治療顱內(nèi)動脈瘤也具有較大的參考價值和指導(dǎo)意義。

簡介：對羥基苯甲酸作為合成對羥基苯甲酸酯類的重要前體，具有重要的應(yīng)用價值，其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式為利用石油中有效成分進(jìn)行合成，對環(huán)境污染較大，因此，近年來眾多科研工作者投入到對羥基苯甲酸的生物合成中。本研究以釀酒酵母為宿主，在釀酒酵母中構(gòu)建對羥基苯甲酸的生產(chǎn)途徑，并通過提升相關(guān)途徑通量，實現(xiàn)對羥基苯甲酸產(chǎn)量的逐步提高。1在釀酒酵母中構(gòu)建對羥基苯甲酸的合成途徑。引入大腸桿菌及惡臭假單胞菌來源的UBIC基因，構(gòu)建分支酸到對羥基苯甲酸的生產(chǎn)途徑，通過比較不同來源基因，確定在釀酒酵母中，大腸桿菌來源的UBIC基因表達(dá)效果更好，并比較了不同啟動子對UBIC基因的表達(dá)效果，最高產(chǎn)量達(dá)到1134±013MGL1。2對釀酒酵母中莽草酸途徑進(jìn)行改造。通過構(gòu)建質(zhì)粒181TEF2PARO4CYCLTTEF1PUBICCYCLT，過表達(dá)ARO4基因，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，解除反饋抑制作用，并通過更換啟動子增加實驗平行性，使產(chǎn)量達(dá)到了3209±077MGL1。在此基礎(chǔ)上，在釀酒酵母基因組上整合大腸桿菌來源莽草酸途徑基因、提升釀酒酵母自身莽草酸途徑基因ARO1的表達(dá)量，并通過過表達(dá)編碼分支酸合酶ARO2基因，對羥基苯甲酸產(chǎn)量達(dá)到了3522±174MGL1。3對釀酒酵母中磷酸戊糖途徑進(jìn)行改造。在基因組上替換ZWF1基因啟動子為強啟動子TEF1P。同時，針對磷酸戊糖途徑基因TKL1、RKI1進(jìn)行過表達(dá)，使產(chǎn)量提升了696％。最后對磷酸戊糖途徑負(fù)調(diào)控因子RIC1基因進(jìn)行敲除，對羥基苯甲酸產(chǎn)量提升597％。4對釀酒酵母中糖酵解途徑進(jìn)行改造。敲除糖酵解途徑旁路基因PYK2，增加莽草酸途徑前體PEP積累量。引入變形鏈球菌來源基因GAPN，通過該基因的過表達(dá)，提升糖酵解途徑通量，并組合ARO2基因進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建質(zhì)粒195ACT1ARO2PGI1TGPD1PGAPNPGI1T，產(chǎn)量達(dá)到3860±196MGL1。

簡介：分類號密級479公玨單位代碼學(xué)號100862009084BT工程菌HD8EA2的構(gòu)建及CRY8EA2蛋白對華北大黑鰓金龜中腸微生物的影響CONSTRUCTIONOFENGINEERINGBTSTRAINHD8EA2ANDIMPACTOFCRY8EA2ONMIDGUTMICROORGANISMSOFHOLOTRICHIAOBLITA學(xué)位申請人指導(dǎo)教師學(xué)科專業(yè)學(xué)位類別授予單位答辯日期王偉郭巍教授生物化學(xué)與分子生物學(xué)理學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二。一二年五月二十六日摘要I111IIIILULIIIIIIIIIY2143864華北大黑鰓金龜HOLOTRICHIAOBLITA屬于鞘翅目金龜甲總科SCARABAEOIDAE，其幼蟲對農(nóng)、林、牧草等都有為害，在我分布廣泛，種群數(shù)量大，危害嚴(yán)重。蘇云金桿菌BACILLUSTHURINGIENSIS，簡稱BT是革蘭氏陽性細(xì)菌G，在其生活史中能產(chǎn)生多種殺蟲晶體蛋白，是目前應(yīng)用最為廣泛而有效的一種生物殺蟲劑。本研究從全國各地的土樣中篩選得到含CRY8類基因的野生型菌株GWLL，該菌株對華北大黑鰓金龜具有殺蟲活性，LC50為643106CELL／ML。CRY8EA2蛋白是一種新型蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白。本研究通過穿梭載體PSXY422B將CRY8EA2導(dǎo)入BT無晶體突變菌株HD73。CRY’中，獲得工程菌HD8EA2。CRY8EA2蛋白在工程菌中獲得表達(dá)。通過分子篩層析，成功獲得純化的130KDA活性毒蛋白。用改進(jìn)的生物活性測定方法進(jìn)行CRY8EA2蛋白對華北大黑鰓金龜一齡幼蟲的殺蟲活性測定，LCSO為026791AG／ML。本研究應(yīng)用16SRDNAPCR。RFLP方法，對J下常生長的華北大黑鰓金龜二齡幼蟲和飼喂CRY8EA2蛋白的二齡幼蟲中腸微生物進(jìn)行了研究。從正常生長和飼喂CRY8EA2蛋白的二齡幼蟲中分別得到300個含有16SRDNA的克隆，分別隨機挑選24個克隆進(jìn)行PCRRFLP的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)源自正常二齡幼蟲的的24個克隆呈現(xiàn)17種不同帶型；源自飼喂CRY8EA2蛋A的二齡幼蟲的24個陽性克隆呈現(xiàn)5種不同帶型。關(guān)鍵詞蘇云金桿菌；華北大黑鰓金龜；CRYEA2蛋白；BT工程菌；生物活性測定中腸微生物；16SRDNA

簡介：第一部分單抗CD44生物素親和素綁定技術(shù)提高軟骨細(xì)胞與殼聚糖無孔膜黏附力的實驗研究目的考察單抗CD44生物素BIOTIN親和素AVIDIN綁定技術(shù)CBA技術(shù)能否在構(gòu)建的軟骨細(xì)胞二維培養(yǎng)體系中提高軟骨細(xì)胞與殼聚糖無孔膜表面的黏附能力。方法軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定，制備殼聚糖無孔膜。制備軟骨細(xì)胞二維培養(yǎng)體系，分3組A殼聚糖無孔膜軟骨細(xì)胞常規(guī)組；B生物素親和素化殼聚糖無孔膜軟骨細(xì)胞BA技術(shù)組；C生物素化單抗CD44親和素化殼聚糖無孔膜軟骨細(xì)胞CBA技術(shù)組。分別在細(xì)胞種植后的1H、2H、4H、12H和24H，用相差顯微鏡對細(xì)胞的生長黏附情況進(jìn)行照相分析，并利用圖像軟件對各組細(xì)胞的展平面積測定并統(tǒng)計，分析軟骨細(xì)胞對殼聚糖無孔膜表面的黏附能力。結(jié)果C組的大部分細(xì)胞在接種后1H就已經(jīng)張開并展平，而B組和A組細(xì)胞則分別需要2H和12H才能達(dá)到大致相同的形狀。C組細(xì)胞的展平面積明顯大于B組和A組。接種后4H，25％的C組細(xì)胞的面積達(dá)到15002000ΜM2，而B組同期只有15％，A組則要到24H后才能達(dá)到15％。各組展平面積隨時間延長遞增，各時間點平均展平面積C組B組A組，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義P結(jié)論BIOTINAVIDIN綁定技術(shù)能比常規(guī)接種方法提高軟骨細(xì)胞與殼聚糖無孔膜黏附能力，但是相比而言，單抗CD44BIOTINAVIDIN綁定技術(shù)對于軟骨細(xì)胞粘附能力的提高更加顯著。第二部分單抗CD44生物素親和素綁定技術(shù)提高軟骨細(xì)胞與殼聚糖三維支架黏附力及體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究目的觀察單抗CD44生物素BIOTIN親和素AVIDIN綁定技術(shù)在構(gòu)建的軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)體系中能否提高軟骨細(xì)胞與殼聚糖支架的黏附能力，在體外構(gòu)建的組織工程軟骨TISSUEENGINEERINGCARTILAGE，TEC能否促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)。方法制備軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)體系，分3組A殼聚糖三維支架軟骨細(xì)胞常規(guī)組；B生物素親和素化殼聚糖三維支架軟骨細(xì)胞BA技術(shù)組；C生物素化單抗CD44親和素化殼聚糖三維支架軟骨細(xì)胞CBA技術(shù)組。軟骨細(xì)胞接種后分別用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)脫落細(xì)胞，測定接種細(xì)胞脫落率；MTT法生長曲線測定殼聚糖支架內(nèi)軟骨細(xì)胞增殖率；掃描電鏡觀察細(xì)胞支架復(fù)合體上細(xì)胞生長情況；生物化學(xué)檢測TEC內(nèi)的DNA和GAG含量；組織學(xué)切片觀察TEC內(nèi)軟骨細(xì)胞的增殖和胞外基質(zhì)的表達(dá)情況；RTPCR法檢測Ⅱ型膠原COLⅡ、AGGRECAN、SOX9的MRNA表達(dá)。結(jié)果細(xì)胞接種脫落率A組為C組的371倍，為B組的217倍，而B組為C組的171倍，A組B組C組PB組A組P結(jié)論單抗CD44BIOTINAVIDIN綁定技術(shù)能比BIOTINAVIDIN綁定技術(shù)更顯著的提高軟骨細(xì)胞與支架的黏附能力，并更有助于促進(jìn)TEC種子細(xì)胞的增殖和軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)。第三部分單抗CD44生物素親和素綁定技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的效果研究目的觀察單抗CD44生物素BIOTIN親和素AVIDIN綁定技術(shù)，在體外構(gòu)建的組織工程軟骨移植修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的效果。方法如第二部分所述分3組構(gòu)建組織工程軟骨。軟骨細(xì)胞接種后測定接種細(xì)胞脫落率；REALTIMEPCR法檢測組織工程軟骨Ⅱ型膠原COLⅡ、AGGRECAN及SOX9的MRNA表達(dá)。分4組修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨全層缺損A組植入殼聚糖支架軟骨細(xì)胞常規(guī)組；B組植入BA技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨BA技術(shù)組；C組植入CBA技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨CBA技術(shù)組；D組植入自體軟骨自體組。12、24周后取出標(biāo)本行大體觀察并行MAN評分；生物力學(xué)方法評估標(biāo)本彈性模量和剛度；免疫印跡WESTERNBLOT檢測新生軟骨組織內(nèi)的COLⅡ、AGGRECAN目的蛋白含量；對標(biāo)本行組織學(xué)HE染色、甲苯胺藍(lán)染色和免疫組織化學(xué)染色并行WAKITANI組織學(xué)評分。結(jié)果細(xì)胞接種脫落率A組B組C組PB組A組PC組，但無統(tǒng)計學(xué)差異P005，C組B組A組PC組B組A組P005，C組結(jié)論BIOTINAVIDIN綁定技術(shù)比常規(guī)接種方法所構(gòu)建的組織工程軟骨對豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的修復(fù)效果好，但是相比而言，單抗CD44BIOTINAVIDIN綁定技術(shù)所構(gòu)建的組織工程軟骨的修復(fù)效果更佳，雖然仍未達(dá)到自體移植修復(fù)水平，但部分指標(biāo)和自體移植已無統(tǒng)計學(xué)差異。

簡介：組織工程作為一門新興的跨學(xué)科領(lǐng)域，近20年來得到了較大的發(fā)展，該領(lǐng)域涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、材料科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物工程等諸多學(xué)科，旨在將細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)相結(jié)合，在體外或體內(nèi)構(gòu)建組織或器官，用以解決組織和器官的缺失或衰竭引起的問題。骨病變或缺損在臨床上比較常見，其治療特別是大段骨缺損的治療是一個非常棘手的問題，組織工程的發(fā)展為骨缺損的修復(fù)治療開辟了一條嶄新的道路。應(yīng)用骨組織工程臨床治療骨缺損改變了治療骨缺損的傳統(tǒng)治療模式，成為目前研究的熱點。骨組織工程利用工程材料學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法再生新的骨組織，以修復(fù)和替代病變或缺損的骨組織，或增進(jìn)其功能，為最終實現(xiàn)微創(chuàng)修復(fù)和真正意義上的功能重建開辟新的途徑。骨組織是一種由納米磷灰石和膠原組成的天然復(fù)合材料，在組成和結(jié)構(gòu)上類似的羥基磷灰石聚合物復(fù)合生物材料已成為當(dāng)前硬組織修復(fù)材料研究的重點和發(fā)展方向。本論文選擇納米羥基磷灰石NANOHYDROXYAPATITE，NHA和降解型聚酰胺6POLYAE6，PA6制備出的納米羥基磷灰石聚酰胺6復(fù)合材料NANOHYDROXYAPATITEPOLYAE6，NHAPA6作為骨組織工程的支架材料，其化學(xué)組成與骨組織非常相似，具有良好的生物相容性和力學(xué)相容性，且在體內(nèi)隨時間會發(fā)生緩慢降解。在制備工藝上選擇對傳統(tǒng)的粒子瀝濾法進(jìn)行了改進(jìn)，克服了其只能制做膜材料，無法獲得三維空間支架的缺點，制備出孔間相互貫通，微孔豐富，孔隙率約為80％的多孔支架。本論文在對NHAPA6多孔支架材料理化表征后，開展了體外細(xì)胞試驗和動物體內(nèi)植入試驗，對該支架材料的生物安全性進(jìn)行了初步評估，并初步構(gòu)建具有活性的組織工程骨支架，探討NHAPA6作為組織工程支架材料的可行性。細(xì)胞試驗表明，NHAPA6支架材料不影響細(xì)胞的骨向誘導(dǎo)和分化，具有良好的生物相容性；而且還起到模板作用，為細(xì)胞提供賴以寄宿、生長、分化和增殖的場所。動物植入試驗表明，NHAPA6支架材料具有良好的組織相容性，其各級別的孔隙有利于血管、骨細(xì)胞的長入，從而誘導(dǎo)新骨生成。構(gòu)建的組織工程骨的動物植入試驗表明，組織工程骨能縮短骨愈合時間。因此NHAPA6多孔支架材料是較理想的骨組織工程支架材料。

簡介：分類號UDC密級編號角方霜糾碩士學(xué)位論文基于3D生物打印技術(shù)的微結(jié)構(gòu)對組織工程表皮中干細(xì)胞行為的影晌THREEDIMENSIONALBIOPRINTEDMICROARCHITECTUREINVOLVESINTHEBEHAVIOROFEPITHELIALSTEMCELLSINTISSUEENGINEERINGEPIDERMIS導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型論文提交日期劉煜凡吳旭外科學(xué)胸心外專業(yè)型2017年5月碩士學(xué)位論文基于3D生物打印技術(shù)的微結(jié)構(gòu)對組織工程表皮中干細(xì)胞行為的影響碩士研究生劉煜凡指導(dǎo)老師吳旭摘要背景皮膚是機體最大的器官，因燒、創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚大面積損傷會造成機體局部畸形、皮膚功能失調(diào)，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡甚至危及生命。因此，針對創(chuàng)傷后皮膚的修復(fù)再生是臨床上亟待解決的問題?；诮M織工程技術(shù)制成的皮膚替代物一度成為有效的修復(fù)途徑，但這種皮膚替代物缺少汗腺、皮脂腺、毛囊等皮膚附屬器，無法恢復(fù)正常皮膚的生理功能。目前，針對皮脂腺、毛囊的再生研究已相對成熟，但針對汗腺再生的研究進(jìn)展緩慢，有功能的再生汗腺有助于提高機體對外環(huán)境的適應(yīng)能力和恢復(fù)排汗功能。表皮干細(xì)胞作為皮膚發(fā)育的‘祖細(xì)胞，在分化為皮膚和皮膚附屬器時有顯著的優(yōu)勢，是汗腺再生研究中首選的干細(xì)胞類型。本團隊在前期已證實3D微結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞分化為汗腺細(xì)胞，但不同構(gòu)架的3D微結(jié)構(gòu)在誘導(dǎo)效應(yīng)上有差別，這為后續(xù)基于3D生物打印技術(shù)的汗腺再生研究在結(jié)構(gòu)選擇上造成了的困難。因此探索不同構(gòu)架的3D微結(jié)構(gòu)對表皮干細(xì)胞行為的影響并建立穩(wěn)定且具良好誘導(dǎo)效應(yīng)的3D微結(jié)構(gòu)是后續(xù)研究的重要基礎(chǔ)。目的基于3D生物打印技術(shù)探索不同構(gòu)架的微結(jié)構(gòu)對表皮干細(xì)胞行為學(xué)變化的影響并建立穩(wěn)定且具良好誘導(dǎo)效應(yīng)的3D微結(jié)構(gòu)，為創(chuàng)傷后皮膚的修復(fù)與再生提供理論基礎(chǔ)。方法1、表皮干細(xì)胞的提取胚胎期125天的GFPC57BL／6小鼠，剪取其背部皮膚后，采用已成熟的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。2、足趾部真皮基質(zhì)勻漿選擇出生后O5天的野生型C57BL／6小鼠，剪取其足趾部研磨成真皮基T

簡介：背景椎間盤退行性疾病DISCDEGENERATIVEDISEASE，DDD是一類以椎間盤INTERVERTEBRALDISC，IVD髓核NUCLEUSPULPOSUS，NP退變?yōu)楹诵牟±碜兓⒁訬P碎裂、IVD突出為主要病理結(jié)果，進(jìn)而引起一系列臨床癥狀的脊柱疾患，其人群發(fā)病率極高，嚴(yán)重影響中老年人的勞動能力和生活質(zhì)量，已成為日益突出的社會健康問題。目前，針對DDD的治療均以緩解和改善臨床癥狀為目的，尚無修復(fù)退變碎裂的NP、重建IVD的生物力學(xué)功能的臨床治療手段。組織工程技術(shù)的發(fā)展為NP的再生修復(fù)展現(xiàn)出嶄新的前景，日益受到廣泛關(guān)注。目的IVD在體內(nèi)主要是發(fā)揮生物力學(xué)功能，承載著較高的應(yīng)力負(fù)荷，其中NP更是承載了脊柱所受到的70％軸向應(yīng)力負(fù)荷。因此組織工程髓核TISSUEENGINEEREDNUCLEUSPULPOSUS，TENP在植入體內(nèi)時應(yīng)具有良好的力學(xué)性能和生物學(xué)功能，保證在較高的應(yīng)力負(fù)荷下TENP可以維持其結(jié)構(gòu)和功能，為NP組織提供再生模板，恢復(fù)IVD的生物力學(xué)功能，重建脊柱的生物力學(xué)。然而，目前TENP的生物力學(xué)性能的不足是限制TENP進(jìn)一步發(fā)展的重要瓶頸問題之一。本研究旨在構(gòu)建一種具有較強力學(xué)性能和生物活性的TENP，然后在此基礎(chǔ)之上，研究不同強度軸向壓應(yīng)力對TENP內(nèi)髓核細(xì)胞NPCS生物學(xué)功能的影響。方法本課題在前期研究的基礎(chǔ)之上，制備了一種由天然材料氧化葡聚糖OXIDATIVEDEXTRAN，ODEX、氨基化明膠（AMINOGELATIN，MGEL）以及合成材料四臂聚乙二醇丙烯酸酯4ARMPOLYETHYLENEGLYCOLACRYLATE，4APEGACR構(gòu)成的、適用于NP修復(fù)的強化力學(xué)性能多層互穿多聚物網(wǎng)絡(luò)（INTERPERATINGPOLYMERWK，IPN）水凝膠。本研究通過調(diào)整IPN水凝膠中4APEGACR的比例，檢測孔徑、孔隙率、力學(xué)性能、水合能力以及細(xì)胞相容性等理化性能，以優(yōu)化篩選適用于TENP的性能最優(yōu)的、仿生的IPN水凝膠，然后觀察該IPN水凝膠內(nèi)三維（THREEDIMENSIONAL，3D）培養(yǎng)的NPCS增殖活性、生化成分含量、NP特異性基因和胞外基質(zhì)EXTRACELLULARMATRIX，ECM相關(guān)蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)之上，將TENP置入前期自主研發(fā)的“智能化反饋調(diào)控組織軸向應(yīng)力仿生施加及培養(yǎng)系統(tǒng)”中，運用不同強度的動態(tài)軸向壓應(yīng)力加載于TENP以增強其生物學(xué)功能，觀察不同強度的壓應(yīng)力對TENP的細(xì)胞增殖活性、ECM合成、細(xì)胞表型、合成代謝、分解代謝、炎癥相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞骨架的影響，探索軸向壓應(yīng)力對TENP生物學(xué)功能的效應(yīng)“窗”，尋找對TENP生物學(xué)功能發(fā)揮正向調(diào)控作用的軸向壓應(yīng)力的適宜強度。結(jié)果1由4APEGACR、ODEX和MGEL通過兩步交聯(lián)反應(yīng)制成的IPN水凝膠是適用于NP組織工程的良好支架材料。當(dāng)三者的成分比例為2∶3∶5時，該水凝膠具有仿生的3D結(jié)構(gòu)、高孔徑、高強度、高韌性、與NP類似的吸水膨脹能力以及良好的細(xì)胞相容性。接種于該水凝膠中的NPCS具有良好的增殖活力，并維持了天然的表型，具有良好的生物合成能力。2不同強度的軸向壓應(yīng)力對TENP的生物學(xué)功能產(chǎn)生了不同的影響。根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)，低強度的壓應(yīng)力1％～10％尤其是壓縮量為1％的壓應(yīng)力可以有效地增強TENP的細(xì)胞增殖活性和合成代謝能力，減少了NPCS的分解代謝、炎癥相關(guān)基因表達(dá)和凋亡，并維持細(xì)胞正常的類圓形結(jié)構(gòu)而高強度的壓應(yīng)力15％20％對TENP的生物學(xué)功能起到了負(fù)性調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致了NPCS的分解代謝、炎癥相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)，合成代謝減少，波形蛋白的表達(dá)升高且細(xì)胞形態(tài)呈長梭形改變。全文結(jié)論由4APEGACR、ODEX和MGEL通過兩步交聯(lián)反應(yīng)制成的IPN水凝膠是適用于NP組織工程的良好支架材料，當(dāng)三者的成分比例為2∶3∶5時該水凝膠具有強化的力學(xué)性能和良好的細(xì)胞相容性，有利于承載一定強度的應(yīng)力負(fù)荷。以該水凝膠為支架構(gòu)建的TENP在低強度的應(yīng)力作用（110％）尤其是壓縮量為1％的低強度壓應(yīng)力作用下，細(xì)胞維持了天然的類圓形結(jié)構(gòu)，內(nèi)部細(xì)胞增殖活性和合成代謝能力明顯增強，進(jìn)一步增強了TENP的生物活性然而，高強度的壓應(yīng)力作用（15％20％）對TENP的生物學(xué)功能起到了負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。本研究制備具有良好的力學(xué)性能和生物活性的TENP，并發(fā)現(xiàn)低強度壓應(yīng)力可以增強TENP的生物學(xué)功能，為其臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)和提供了理論依據(jù)。