簡介：該研究旨在建立一種檢測不同動物HEV抗體的ELISA方法調(diào)查不同動物對HEV的易感性探討HEV抗體對不同重組抗原的反應(yīng)性主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下一、動物HEVF2基因的克隆和表達用逆轉(zhuǎn)錄巢式PCRRTPCR擴增HEV新西蘭豬病毒株NZSF2的部分基因片段并克隆到PGEX4T2載體上用雙酶切和測序的方法進行鑒定然后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109IPTG誘導(dǎo)表達P166NZS親和層析純化表達產(chǎn)物并用PAGE電泳進行鑒定雙酶切鑒定和測序的結(jié)果說明目的基因正確連接到載體上電泳結(jié)果證實P166NZS成功表達而且所表達的重組蛋白純度高二、用多基因型的HEV重組蛋白建立雙抗原夾心法ELISADSELISA用P166MIX和HRP標(biāo)記的P166MIX建立DSELISA用DSELISA檢測3只實驗感染HEV的靈長類動物系列血清結(jié)果顯示3只實驗動物感染HEV之前和感染后短時間內(nèi)HEV抗體陰性23月后陽轉(zhuǎn)說明新建立的DSELISA方法可以用于感染不同基因型HEV的不同動物血清HEV抗體的檢測三、與人類生活關(guān)系密切的7種動物血清HEV抗體和HEVRNA的檢測用血清學(xué)和PCR方法研究與人類生活關(guān)系密切的7種動物對HEV的易感性結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬、家犬和寵物狗血清標(biāo)本中存在HEV抗體警犬、山羊、雞、鴨、鴿子和兔血清標(biāo)本中未檢測到HEV抗體犬血清標(biāo)本用RTNPCR未擴增出HEVRNA表明用多基因型HEV重組蛋白建立的雙抗原夾心法ELISA適用于多種動物血清標(biāo)本HEV抗體的檢測豬和犬對HEV易感在HEV傳播中可能起重要作用四、人和動物血清抗HEV抗體血清學(xué)關(guān)系的研究將代表四種基因型的HEV重組蛋白分別包被酶標(biāo)板對實驗感染HEV的靈長類動物血清以及部分HEV抗體陽性的人和動物血清標(biāo)本進行檢測分析人和動物血清HEV抗體對不同HEV重組蛋白反應(yīng)性的差異結(jié)果顯示用與所感染HEV病毒株相同基因型的重組蛋白檢測效果最好P166PAK對部分感染第Ⅳ基因型HEV病毒株的實驗動物血清缺乏反應(yīng)性大部分病人和動物血清標(biāo)本用P166NZS和P166CHI檢測效果較好部分標(biāo)本對P166PAK和P166MEX反應(yīng)性較差提示人和動物HEV抗原性存在交叉但與基因型有關(guān)人HEV第1基因型重組蛋白會對部分感染HEV第Ⅳ基因型病毒株的個體所產(chǎn)生的抗體缺乏反應(yīng)性我們的研究結(jié)果表明用人和動物的多基因型和亞型的HEV重組蛋白建立的檢測HEV抗體的雙抗原夾心法ELISA適用于感染不同基因型HEV病毒株的不同動物血清HEV抗體的檢測豬和犬對HEV易感它們在HEV傳播過程中可能起了重要作用HEV抗體對不同基因型HEV重組蛋白的反應(yīng)性有差別用與所感染的HEV病毒株屬于同一個基因型的重組蛋白作為檢測抗原最佳第Ⅰ基因型重組蛋白對部分第Ⅳ基因型HEV病毒株感染所產(chǎn)生的抗體缺乏反應(yīng)性單用第Ⅰ基因型重組蛋白作為檢測抗原容易造成漏診多基因型HEV重組蛋白混合物是HEVELISA診斷檢測抗原的最佳候選

簡介：病毒性肝炎是我國的常見、多發(fā)病，其中乙型肝炎病毒HBV慢性感染是導(dǎo)致肝細胞癌的主要危險因子之一。乙型肝炎病毒變異性高，其基因組包括四個開放閱讀框C、P、S、X，其中HBX編碼的蛋白是一種多功能性蛋白，為病毒基因組轉(zhuǎn)錄所必需，在乙型肝炎病毒的復(fù)制、細胞生長、DNA修復(fù)及凋亡過程中起重要作用。因此，對HBX進行深入研究具有極其重要的理論和臨床意義。細胞毒性T淋巴細胞是細胞免疫應(yīng)答的核心成分，通過受體與帶有CTL表位即抗原肽的MHCI類分子互相作用，溶解、殺傷靶細胞。抗原肽是抗原中能被免疫細胞特異性識別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位，在機體免疫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，抗原表位的選擇也是能否獲得特異性抗體的關(guān)鍵。由于HBX表位可以被不同的MHCI類分子所識別、遞呈，在這些MHCI類分子中，中國人群中HLAA2陽性的人群高達50％，因此對HLAA0201限制性的CTL表位進行研究具有更大的現(xiàn)實意義。迄今為止，HBV被分為八個不同的基因型AH，以及眾多的血清型。我們選擇了中國人群中最常見B基因型中的ADW血清型和C基因型中的ADR血清型的基因序列作為研究對象，分別通過三個提供表位預(yù)測服務(wù)的網(wǎng)絡(luò)站點，以及超基序、延展基序和量化基序等方案預(yù)測獲得4條九肽作為候選表位HBXVLCLRPVGA、HBX2CLFKDWEEL、HBX3VLHKRTLGL、HBX4HLSLRGLPV。由于預(yù)測結(jié)合并不等于實際結(jié)合，并且實際結(jié)合也并不意味著真正具有免疫原性，所以有必要通過體內(nèi)、體外實驗對預(yù)測表位的結(jié)合能力、免疫原性進行進一步的免疫學(xué)鑒定。為此，我們根據(jù)文獻分別選擇了陽性肽HBCFLPSDFFPSI以及陰性肽HBC，HLAA2402EYLVSFGVW作為陽性、陰性參照。T2細胞作為一種免疫學(xué)研究的工具，其表面空載的HLAA0201分子表達極不穩(wěn)定，而外源性抗原肽的結(jié)合能夠提高HLAA0201分子的穩(wěn)定性，因此我們通過T2細胞結(jié)合實驗和結(jié)合穩(wěn)定性實驗檢測各候選表位與HLAA0201分子結(jié)合的親和力、穩(wěn)定性，四條候選表位中HBX2的親和力和穩(wěn)定性最高。為了進一步檢測各候選表位在體內(nèi)環(huán)境中的免疫原性，我們以HLAA21K轉(zhuǎn)基因鼠為模型，模擬體內(nèi)環(huán)境，對四條候選表位刺激脾細胞釋放IFNΓ的能力和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細胞殺傷能力進行了檢測，四條候選表位中HBX2同樣表現(xiàn)出較高的刺激脾細胞釋放IFNΓ和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細胞殺傷的能力。之后我們分離了HLAA0201陽性慢性活動期乙肝病人外周血中的單個核細胞，通過檢測HBX2和各對照肽體外刺激單個核細胞分泌IFNΓ的能力和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細胞殺傷能力，對HBX2的免疫原性作進一步的鑒定。根據(jù)體內(nèi)、體外鑒定的結(jié)果，我們利用HBX2構(gòu)建了可溶性的肽四聚體，為將該表位進一步應(yīng)用于臨床診斷和治療鋪平了道路。綜上所述，HBX2CLFKDWEEL是一個潛在的HBX來源的HLAA0201限制性CTL表位，具備應(yīng)用于臨床診斷、治療的可能性。我們的研究為進一步深入探討HBX在乙肝和乙肝導(dǎo)致的肝細胞癌中的作用以及慢性乙肝、肝細胞癌的診斷、治療研究打下了良好的基礎(chǔ)。

簡介：背景及目的非酒精性脂肪性肝?。∟ONALCOHOLICFATTYLIVERDISEASENAFLD）是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，包括單純性脂肪肝（SIMPLESTEATOSIS），非酒精性脂肪性肝炎（NONALCOHOLICSTEATOHEPATITIS，NASH），以及NASH相關(guān)的肝纖維化肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提高，NAFLD在發(fā)展中國家的發(fā)病率顯著上升，我國NAFLD患者數(shù)量在過去的10年增加了近一倍，部分地區(qū)的發(fā)病率已達四分之一。同時，我國是病毒性肝炎感染的高發(fā)地區(qū)，約有1億HBV感染者及4000萬HCV感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趨勢，這一部分人群已經(jīng)引起了研究者們的注意。目前關(guān)于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎CHRONICHEPATITISCCHCNAFLD可以增加CHC患者進展為肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMAHCC的風(fēng)險，并降低抗病毒治療的療效。但是，丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUSHCV本身具有致肝細胞脂肪變的作用，因此在NAFLD合并CHC患者中得到的結(jié)論可能并不能推而廣之。關(guān)于NAFLD對慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISBCHB的影響，目前的研究結(jié)果卻并不一致，與CHC中看到的現(xiàn)象也不相同。部分研究認為，肝臟脂肪變對CHB具有保護作用在脂肪肝患者中，乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV載量更低，乙肝病毒表面抗原HEPATITISBSURFACEANTIGENHBSAG清除率更高。但另一方面，一些研究顯示，脂肪肝可能會增加CHB患者發(fā)展為肝硬化及HCC的風(fēng)險，降低恩替卡韋抗病毒治療的效果。還有一些研究認為，脂肪肝對HBV病毒載量及干擾素抗病毒治療無影響。事實上，這方面的研究存在許多難點，可能是導(dǎo)致這些矛盾結(jié)論的原因。首先，研究中多用肝臟超聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內(nèi)脂肪沉積超過30％的中度脂肪肝，難以檢出輕度脂肪肝（肝臟內(nèi)脂肪沉積為5％30％），因此在分組時，可能將輕度脂肪肝患者作為無脂肪肝的對照。其次，在研究NAFLD合并CHB時，難以保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三，人群研究難以獲取肝組織觀察肝內(nèi)免疫、代謝等方面的改變。因此，NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影響仍不明確。動物模型可以克服上述臨床研究中的不足，但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的動物模型。為了更好的研究NAFLD對慢性病毒性肝炎的影響，本研究的具體研究目標(biāo)如下1成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型；2在飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中，動態(tài)觀察肝炎病毒的復(fù)制情況及肝組織損傷程度；3探討NAFLD影響病毒性肝炎病程的相關(guān)免疫學(xué)機制。方法1采用60％高脂飲食（HIGHFATTYDIETHFD）喂養(yǎng)C3HHEN小鼠12周，觀察小鼠一般狀態(tài)及生活習(xí)性改變，觀察體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALANINEAMINOTRANSFERASEALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ASPARTATEAMINOTRANSFERASEAST）、甘油三酯TRIGLYCERIDETG、總膽固醇TOTALCHOLESTEROLTC、高密度脂蛋白HIGHDENSITYLIPOPROTEINHDL、低密度脂蛋白（LOWDENSITYLIPOPROTEINLDL、血糖（GLUCOSEGLU）、胰島素水平及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMEOSTASISMODELASSESSMENTINSULINRESISTANCEHOMAIR）的動態(tài)變化及肝臟組織學(xué)變化。23型鼠肝炎病毒（MURINEHEPATITISVIRUS3MHV3）腹腔注射感染NAFLD小鼠，觀察小鼠一般狀態(tài)及生存率；動態(tài)觀察小鼠感染后血清生化學(xué)變化及肝臟病理改變；逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)（REVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCR）檢測小鼠肝內(nèi)MHV3。3MHV3腹腔感染NAFLD小鼠及正常飲食（NMALDIETND）小鼠，比較兩組小鼠生存率；比較兩組小鼠各時間點血清生化學(xué)變化及肝組織病理改變；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)REALTIMEPOLYMERASECHAINREACTIONREALTIMEPCR檢測并比較各時間點兩組小鼠肝內(nèi)MHV3復(fù)制情況。4流式細胞術(shù)檢測MHV3感染后各時間點小鼠肝內(nèi)CD3CD8CD69T細胞、CD3CD8PD1T細胞、CD4CD25FOXP3TREG細胞比例的變化，并比較兩組小鼠之間的差異；REALTIMEPCR檢測并比較兩組小鼠MHV3感染后各時間點肝內(nèi)IL1Β、IL6、IL10、IL17A、IL22、IL33、TNFΑ、FGL2的表達，并比較兩組小鼠之間的差異。結(jié)果1成功建立NAFLD小鼠模型。HFD飲食喂養(yǎng)12周，C3HHEN小鼠體型肥胖，皮毛油膩，不喜活動，體重明顯增加；外周血ALT及AST水平無顯著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰島素水平及HOMAIR均顯著升高；小鼠肝臟體積增大，肝重高于ND組，邊緣圓鈍，色澤紅黃，表面光滑，有油膩感；肝組織切片HE染色及油紅O染色可見肝細胞內(nèi)大量脂滴形成。2成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，在312天內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡率約為20％；感染小鼠外周血ALT和AST水平顯著升高；感染小鼠肝臟蒼白，缺乏光澤，并可見彌漫分布的針尖樣出血點；HE染色除可見肝細胞內(nèi)脂滴形成，還可見肝細胞胞漿疏松、肝細胞壞死、淋巴細胞浸潤等表現(xiàn)；PCR可檢測到肝內(nèi)MHV3病毒復(fù)制。3NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，生存率與對照組無差異；MHV3病毒復(fù)制高于對照組，于感染4天時有統(tǒng)計學(xué)差異（P0002）；ALT及AST升高幅度大于ND組；肝組織炎癥壞死程度交對照組嚴(yán)重。4NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，肝內(nèi)IL1Β、IL6、IL10、IL17A、IL33、TNFΑ、FGL2表達水平上調(diào)，且上調(diào)幅度大于ND組小鼠，而IL22表達水平降低，且降低幅度大于對照組小鼠。5NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，肝內(nèi)CD4CD25FOXP3TREG細胞比例降低，但感染第16天開始高于ND組小鼠；CD3CD8CD69T及CD3CD8PD1T細胞均出現(xiàn)升高，上升幅度大于ND組小鼠，且細胞比例回落后仍持續(xù)高于ND組小鼠。結(jié)論1本研究采用HFD喂養(yǎng)C3HHEN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上采用MHV3病毒腹腔感染小鼠，成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。為研究NAFLD對病毒性肝炎的影響提供了動物模型，開辟了新的研究途徑。2NAFLD可以加劇肝內(nèi)MHV3病毒復(fù)制，加重肝內(nèi)炎癥反應(yīng)。3NAFLD在病毒性肝炎感染早期可以促進肝內(nèi)細胞因子的釋放，使CD3CD8CD69T比例增加，CD4CD25FOXP3TREG比例降低，可導(dǎo)致肝內(nèi)炎癥壞死加重的。而感染后期CD4CD25FOXP3TREG及CD3CD8PD1T細胞比例的增加，有可能阻礙病毒清除。

簡介：目的分析乙肝病毒HEPATITISBVIRUS，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)RTI233V變異的演變規(guī)律及其與阿德福韋酯ADV耐藥的相關(guān)性。方法分析了9830例慢性HBV感染者血清樣本中HBVRTI233V變異的檢出率。選擇其中2例代表性患者的動態(tài)收集血清樣本，擴增HBVRT基因并克隆測序（＞20個克隆樣本）以觀察RTI233V變異的演變過程。構(gòu)建PTRIEXHBV11倍野生株WT、3種臨床變異株RTI233V、RTN236T、RTI233VRTN236T和定點回復(fù)突變株RTN236T復(fù)制子，瞬時轉(zhuǎn)染入HEPG2肝癌細胞，分別加入不同濃度梯度或最高濃度的拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV和替諾福韋TDF作用，采用實時熒光定量PCR法檢測不同藥物濃度作用后細胞培養(yǎng)上清中HBVDNA水平，分析變異病毒復(fù)制力與表型耐藥變化特點。結(jié)果9830例慢乙肝患者血清樣本中共檢出RTI233V位點變異28例，檢出率為028％，其中RTI233V單獨變異19例，與RTN236T等經(jīng)典耐藥變異聯(lián)合出現(xiàn)9例。該變異的檢出患者均有ADV治療史，其中16例571％接受ADV單藥治療6個月以上，12例429％接受包括ADV的多藥序貫聯(lián)合治療1年以上?；颊?相對病毒復(fù)制力與表型耐藥分析顯示，RTI233V變異株的復(fù)制力與野生株接近982％，RTN236T變異株則較野生株顯著降低554％RTI233VRTN236T變異株的相對病毒復(fù)制力為野生株的1004％，表明RTI233V變異可明顯恢復(fù)RTN236T變異株受損的復(fù)制力RTN236T、RTI233VRTN236T和RTI233V變異株對ADV的敏感性分別為野生株的1682，1528和1157，RTN236T和RTI233VRTN236T變異株對ADV耐藥，而RTI233V變異株對ADV仍然敏感，與RTN236T聯(lián)合變異對ADV耐藥性的影響不大。患者2RTI233V變異株的相對病毒復(fù)制力為野生株的1025％對ADV的敏感性為野生株的1076。RTI233V變異株對ADV及LAM、ETV和TDF均敏感。ADV對臨床變異株RTI233VRTN236T和定點回復(fù)突變株RTN236TLAB的抑制率相似，進一步證實RTI233V變異株對ADV耐藥性影響不大。結(jié)論RTI233V位點變異與ADV應(yīng)答不佳相關(guān)，但不直接降低病毒對ADV的敏感程度，可以恢復(fù)經(jīng)典ADV耐藥病毒株的復(fù)制力，是一種復(fù)制力補償變異。

簡介：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文慢性活動性EPSTEINBARR病毒感染患兒的臨床診斷方法及免疫學(xué)機制的研究姓名邢燕申請學(xué)位級別博士專業(yè)兒科指導(dǎo)教師魏珉宋紅梅20080630中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研究生學(xué)位論文AEBV血液學(xué)方面的診斷包括外周血白細胞升高且以淋巴細胞升高為主、異型淋巴細胞10％，而進一步淋巴亞群分析往往提示這些增多的細胞為CD38DRCD8的T淋巴細胞。而CAEBV在血液學(xué)和淋巴亞群方面是否有可以協(xié)助CAEBV臨床診斷的、不同于AEBV和正常兒童的特點，至今還沒有這方面的報道。外周血單個核細胞PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS，PBMC總DNA水平一樣的患兒不等于EBV在各種淋巴細胞的感染程度和引起的免疫細胞應(yīng)答一樣，有報道EBV感染T細胞為主型與CAEBV的高死亡率呈正相關(guān)性，需要早行骨髓移植等的更積極的治療方案。國內(nèi)常規(guī)的檢測外周血EBVODNA的方法不能區(qū)分EBV感染的淋巴細胞種類，進而不能明確CAEBV患兒EBV更具體的感染情況，因此明確CAEBV的感染細胞類型，幫助A垣BV的臨床分型診斷，可能對更深入的研究其病毒學(xué)發(fā)病機制、指導(dǎo)個體化診治及判定預(yù)后有重要意義。關(guān)于CAEBV的發(fā)病機制方面，病毒抗原自身和宿主兩方面的因素導(dǎo)致EBV免疫逃逸的機制在CAEBV的發(fā)病過程中可能起了重要作用。宿主針對EBV的正常免疫應(yīng)答包括固有免疫和獲得性又稱適應(yīng)性免疫。國外研究顯示，宿主的適應(yīng)性細胞免疫應(yīng)答特別是EBV特異的CD4T細胞應(yīng)答和CD8T細胞應(yīng)答對EBV的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸有著重要意義，而CAEBV患兒存在細胞免疫功能紊亂與其病情慢性活動性相關(guān)。但目前的研究大多局限于針對CAEBV患兒CD4T細胞、CD8T細胞和NK細胞的變化進行分析，尚沒有CAEBV的T細胞功能亞群、調(diào)節(jié)亞群、初始又稱純真記憶亞群和激活亞群的研究。CAEBV時宿主針對EBV特異的適應(yīng)性細胞免疫應(yīng)答方面，目前CAEBV的發(fā)病機制尚不完全清楚，國外研究顯示，EBV特異的細胞毒T淋巴細胞CYTOXICTLYMPHOCYTE，CTL數(shù)目的減少可能是EBV免疫逃逸的重要機制之一。然而，EBVCTL的數(shù)目并不完全代表宿主針對EBV特異的適應(yīng)性細胞免疫的功能，尤其是EBVCTL功能的真實狀況，目前CAEBV感染尚沒有針對EBV肽段庫方面的CD8的EBV特異CTL功能方面的研究。2

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簡介：目的我國是病毒性肝炎大國，一般人群已成為乙型肝炎、丙型肝炎防治工作的重點，國產(chǎn)酶標(biāo)試劑血清學(xué)檢測結(jié)果并不能反映人群全部感染情況，一些乙型肝炎表面抗原HBSAG陰性的乙型肝炎病毒HBV感染以及急性HBV、丙型肝炎病毒HCV窗口期感染可以通過核酸檢測技術(shù)NAT加以確認，對一般人群進行血液HBV、HCV病毒標(biāo)志物血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測，既可為完善病毒性肝炎防治措施提供有價值的人群陽性率信息，又可為當(dāng)?shù)孬I血人群的篩查改進研究提供流行病學(xué)參考依據(jù)，提高輸血安全。我們研究包括三個方面1采用血清學(xué)方法，對江蘇省部分地區(qū)一般人群乙肝、丙肝病毒標(biāo)志物進行檢測，了解HBSAG陰性人群乙肝血清標(biāo)志物構(gòu)成模式，分析病毒核酸檢測的必要性。2采用核酸檢測技術(shù)，檢測混合血清乙型肝炎病毒核酸HBVDNA、丙型肝炎病毒核酸HCVRNA。3研究混合檢驗法總體率可信區(qū)間估計方法，并估計江蘇省部分地區(qū)一般人群HBVDNA、HCVRNA陽性率可信區(qū)間。研究萬法1按照分層整群隨機抽樣方法，對在金壇市、海門市、海安縣、贛榆縣抽取的一般人群進行HBSAG、乙型肝炎表面抗體HBSAB、乙型肝炎核心抗體HBCAB、丙型肝炎抗體HCVAB檢測。分析不同地區(qū)、不同年齡HBSAG陰性一般人群乙肝血清標(biāo)志物不同模式構(gòu)成。2依據(jù)一般人群血清學(xué)模式構(gòu)成情況，對HBSAG陰性不同血清學(xué)模式的標(biāo)本按12人份進行混合，提取乙肝、丙肝病毒核酸，并采用熒光定量聚合酶鏈檢測技術(shù)RTPCR進行檢測。應(yīng)用混合血清總體率可信區(qū)間估計方法計算一般人群HBVDNA、HCVRNA檢出率。3選取HBVDNA、HCVRNA陽性混合組進行拆分檢測，采用熒光定量PCR檢測單份血清病毒核酸。4對HCVAB酶聯(lián)免疫檢測法ELISA初檢陽性，HBSAGELISA法復(fù)檢陽性血清標(biāo)本提取病毒核酸，用熒光定量PCR技術(shù)進行檢測。5在分析國外SACKS氏方法及KLINE氏方法基礎(chǔ)上，運用校正一次近似法計算混合檢驗法總體率可信區(qū)間，并與精確概率法計算結(jié)果進行比較。研究結(jié)果1江蘇省一般人群HCVAB總陽性率為076％，蘇南地區(qū)的HCVAB陽性率明顯高于蘇中、蘇北地區(qū)。江蘇省一般人群的HBSAG總陽性率為484％，蘇中和蘇南地區(qū)的HBSAG陽性率高于蘇北地區(qū)。在HBSAG陰性人群中，蘇中地區(qū)以單項HBCAB，以及HBSAB伴HBCAB的構(gòu)成居多，明顯高于蘇南、蘇北地區(qū)。2對蘇南、蘇中地區(qū)HBSAG陰性人群檢測HBVDNA的結(jié)果表明，兩個地區(qū)HBSAG陰性人群HBVDNA總檢出率為153％95％CI098％，234％，其中蘇中地區(qū)HBVDNA檢出率為195％95％CI111％，315％，蘇南地區(qū)HBVDNA檢出率為091％9506CI029％，211％。在蘇中地區(qū)HBSAG陰性人群中，HBVDNA陽性結(jié)果主要集中在單項HBCAB，以及HBSAB伴HBCAB者中。另外，蘇南地區(qū)30份HBSAG復(fù)檢陽性的血清中有11份HBVDNA檢測陽性。3江蘇省HBSAG陰性人群HCVRNA陽性率為051％，95％CI是023％，098％；其中，蘇南地區(qū)HCVRNA陽性率最高，為147％95％CI06％，29％，蘇北地區(qū)較低，為03％95％CI00075％，17％，蘇中地區(qū)沒有檢出HCVRNA陽性標(biāo)本。另外，所有HCVAB初檢陽性、復(fù)檢陰性的血清HCVRNA均檢測陰性，27份HCVAB復(fù)檢陽性的血清有11份HCVRNA檢測陽性。4我們提出的總體率可信區(qū)間估計方法與國外的SACKS氏方法及KLINE氏方法進行比較，在陽性率不太低時，幾種方法差別不大，而當(dāng)陽性率較低時，校正一次近似法計算結(jié)果與精確概率法相近，可以得出較理想的非負下限值。結(jié)論1江蘇省蘇中和蘇南地區(qū)一般人群HBSAG陽性率高于蘇北地區(qū)。蘇中地區(qū)HBSAG陰性一般人群中，單項抗HBC，以及抗HBC伴抗HBS的構(gòu)成比高于蘇南、蘇北地區(qū)。2HBSAG陰性人群中HBVDNA檢出率蘇中高于蘇南地區(qū)。在HBSAG陰性人群中，單項抗HBC，以及抗HBC伴抗HBS人群的HBVDNA陽性率應(yīng)引起重視。建議在獻血員血液篩查時考慮進行混合血清HBVDNA檢測以減少HBV感染發(fā)生。3江蘇省蘇南地區(qū)一般人群HCVAB陽性率及HCVRNA檢出率均高于蘇中、蘇北地區(qū)。4混合血清HBVDNA、HCVRNA檢測方法已在江蘇省COO實驗室初步建立。5對于不同混合條件下的混合檢驗陽性率結(jié)果，建議采用校正一次近似法或精確概率法進行陽性率的可信區(qū)間估計。

簡介：重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文重慶地區(qū)嬰幼兒輪狀病毒臨床及分子流行病學(xué)特征研究姓名廖煬申請學(xué)位級別碩士專業(yè)兒科學(xué)（感染消化）指導(dǎo)教師劉作義20100501重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文先用膠體金法初步篩查輪狀病毒并經(jīng)RTPCR逆轉(zhuǎn)錄PCR方法證實為輪狀病毒，然后用巢式RTPCR方法進行VP7G、VP4P基因分型。3統(tǒng)計分析采用SPSS160軟件統(tǒng)計分析相關(guān)臨床資料和實驗數(shù)據(jù)。中位數(shù)比較使用非參數(shù)MANNWHIMEYU檢驗，多個非正態(tài)分布獨立樣本中位數(shù)比較使用非參數(shù)KRUSKALWALLIS檢驗。率的比較使用卡方檢驗。以P值O05為差異有顯著性。4結(jié)果12008年8月“2009年7月共收集標(biāo)本1259份門診1054份，住院205份；男767例，女492例，其中輪狀病毒篩查陽性例數(shù)為453份FLI參359份，住院94份；男266FFIJ，女187例。輪狀病毒總體陽性率為3598％453／1259，其中門診3406％359／1054，住院4585％94／205；男性陽性率3468％266／767，女性陽性率3801％187／492。本研究資料顯示輪狀病毒腸炎患兒主要集中發(fā)生在6個月～14月齡嬰幼兒。重慶輪狀病毒腸炎全年都有發(fā)生，但是主要集中發(fā)生在當(dāng)年的LO月份至次年的2月份，在3、4月份時出現(xiàn)有小高峰，夏季79月份的陽性率全年最低。2分析輪狀病毒流行季節(jié)的10月份至次年2月份嬰幼兒腹瀉情況，此期間共收集至1J507份嬰幼兒大便標(biāo)本，輪狀病毒抗原陽4

簡介：廣一關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬蘭州大學(xué)。本人完全了解蘭州大學(xué)有關(guān)保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保存或向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)蘭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用任何復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時，第一署名單位仍然為蘭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。論文作者簽名襤導(dǎo)師簽名紐日期灶／夕■、／’目錄中文摘要1英文摘要4正文前言7日U舌7第一部分蘭州地區(qū)急性呼吸道感染患兒中呼吸道相關(guān)病毒檢測和臨床研究材料與方法16結(jié)果23J討論37結(jié)論44第二部分人博卡病毒2和C組鼻病毒的臨床特征及分子流行病學(xué)研究第一章人博卡病毒2HBOV2的臨床和分子流行病學(xué)研究45材料與方法45結(jié)果47討論51第二章人鼻病毒C組HRV_C感染的臨床和分子流行病學(xué)研究53材料與方法54結(jié)果55討論57結(jié)論60全文創(chuàng)新點61參考文獻62縮略語表69附圖170附圖272附表176攻讀學(xué)位期間撰寫及發(fā)表的論文77致射78

簡介：最近幾十年來由于全球人口數(shù)量和流動性持續(xù)增加登革熱在全球的流行范圍不斷擴大并已成為目前世界上分布最廣、發(fā)病最多的蟲媒病毒病對人類健康造成嚴(yán)重的威脅。由于缺乏疫苗登革熱的防治一直是世界性難題。除了媒介控制外感染者的及時發(fā)現(xiàn)、隔離以及治療是目前預(yù)防登革熱進一步擴散的重要手段因此早期診斷對于登革熱的預(yù)防控制至關(guān)重要。登革熱的早期診斷一直是登革熱防治研究領(lǐng)域的熱點相關(guān)的實驗診斷技術(shù)也在不斷發(fā)展包括病毒核酸檢測、抗原抗體檢測在內(nèi)的多種實驗診斷技術(shù)已被應(yīng)用于常規(guī)的實驗檢測工作。目前國外已經(jīng)有多家試劑公司研制成功并推出了包括酶聯(lián)免疫吸附法ELISA、膠體金免疫層析法ICT等在內(nèi)的商品化病毒抗體檢測試劑盒此類試劑盒具有快速、操作簡便等特點為大多數(shù)實驗室特別是基層實驗室所采用。近年來國內(nèi)雖然也有不少研究機構(gòu)開展登革病毒抗體檢測試劑盒的研制并有相關(guān)研制的報道但其實際應(yīng)用一直沒有取得突破試劑的國產(chǎn)化一直是國內(nèi)登革熱防控工作的短板。本課題以登革2型病毒外膜蛋白ENVELOPEE為研究對象在其編碼基因的DIII區(qū)上下游各設(shè)計8條引物分別引入NDEI和XHOI兩個酶切位點交叉配對共擴增出64條DIII區(qū)基因片段利用PET30A表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21DE3中分別克隆和表達經(jīng)SDSPAGE和WESTERNBLOT驗證其表達含量及重組蛋白的免疫反應(yīng)性篩選表達量大且有較強免疫反應(yīng)性的重組蛋白抗原進行純化并建立間接ELISA法用以檢測登革熱IGM抗體為國產(chǎn)試劑提供候選抗原和方法。為評價實驗建立的ELISA法檢測效果我們以PANBIO公司生產(chǎn)的登革熱IGM檢測試劑盒作為對照選取112份臨床血清標(biāo)本進行了初步的試劑評估。檢測結(jié)果表明以IFA檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)本研究ELISA法檢測IGM的靈敏度為9464％特異度為9107與PANBIO公司生產(chǎn)試劑盒相比本研究建立的ELISA法檢測登革病毒IGM抗體的檢測陽性符合率為9285陰性符合率為8929總符合率為9107KAPPA值為08214提示兩檢測方法具有較高的一致性且兩種檢測方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義Χ203P005。提示本研究所建立的方法具有較好的應(yīng)用前景。

簡介：目的丙型肝炎病毒（HEPATITISCVIRUS，簡稱HCV）感染是當(dāng)前危害人類健康的重要傳染病之一，目前除干擾素聯(lián)合利巴韋林外尚無有效預(yù)防和治療手段。因此，尋找其他治療途徑，預(yù)防和清除HCV的持續(xù)感染很有必要。而將編碼HCV抗原的外源基因?qū)霗C體誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性T細胞免疫反應(yīng)的HCV新型疫苗目前正在受到人們的重視。以重組復(fù)制缺陷型腺病毒REPLICATIONDEFICIENTRECOMBINANTADENOVIRUS，RAD為載體的疫苗，能模擬天然病毒有效地將外源基因?qū)胨拗骷毎麅?nèi)并使之高效表達，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對目的抗原的免疫應(yīng)答。為此，我們利用ADMAXTM腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建可表達HCV核心抗原CE的HCV重組腺病毒PADCE，并觀察其免疫小鼠后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力，為進一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治療奠定基礎(chǔ)。方法RTPCR法從丙型肝炎患者血清中擴增出HCVCE基因定向克隆到重組腺病毒ADMAXTM系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒PDC315的多克隆位點上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒PDC315CE，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒PBHGLOXDELTAE13CRE共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，通過同源重組包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒PADCE；經(jīng)HEK293細胞擴增后，離子交換柱層析法純化病毒，測定病毒顆粒數(shù)和滴度；利用重組腺病毒體外感染人肝癌細胞株HEPG2，經(jīng)免疫印跡（WESTERNBLOT）方法檢測目的蛋白的表達，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗ENZYME1INKEDIMMUNOSBENTASSAY，ELISA檢測免疫小鼠血清抗體水平，酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTSPOTELISPOT）檢測免疫小鼠特異性T淋巴細胞免疫反應(yīng)。結(jié)果重組腺病毒PADCE經(jīng)PCR及序列測定證實CE基因插入正確，在HEK293細胞中具有良好的感染性；擴增純化后，重組腺病毒的比活性可達342IU100VP，單細胞產(chǎn)量可達263104VPCELL；WESTERNBLOT檢測結(jié)果表明PADCE在HEPG2細胞可穩(wěn)定表達目的蛋白，免疫小鼠后可刺激機體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答。結(jié)論成功構(gòu)建了表達HCV核心抗原CE的HCV重組腺病毒PADCE，該重組腺病毒可在人肝癌細胞株HEPG2細胞內(nèi)穩(wěn)定表達目的蛋白，并且能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，具有成為丙肝疫苗的發(fā)展?jié)摿Α?

簡介：眾所周知，現(xiàn)代免疫學(xué)主要的杰出貢獻是揭示了傳統(tǒng)免疫學(xué)中一系列令人迷惑的現(xiàn)象（1）T細胞通過其TCR分子識別由MHC分子遞呈的抗原肽，而從MHC分子的抗原肽結(jié)合槽中洗脫下來的分子，90％以上為自身抗原肽，包括各種類型的自身MHC分子，提示了T細胞識別自身成分具有的普遍性；（2）免疫應(yīng)答調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)變異可誘發(fā)自身免疫?。唬?）盡管腫瘤患者免疫功能低下，但可檢測到較正常人高得多的自身抗體，并有自身抗原編碼基因的大量激活；（4）幾乎所有引起自身免疫病的病理性淋巴細胞克隆都可以在健康人的淋巴細胞庫（REPERTOIRE）中找到，頻率為1107左右?，F(xiàn)代免疫學(xué)的另一杰出貢獻是預(yù)示了用免疫調(diào)節(jié)和免疫干預(yù)的研究成果解釋了自身免疫病的發(fā)病機制和臨床應(yīng)用的可行性。機體免疫系統(tǒng)藉助正負反饋調(diào)節(jié)維持自身穩(wěn)定，當(dāng)穩(wěn)定遭至破壞即引起的兩個極端性病理效應(yīng)出現(xiàn)腫瘤持續(xù)感染（應(yīng)答不足）和自身免疫?。☉?yīng)答亢進）。就后者而言，可能更多地涉及負反饋機理的失調(diào)。而負反饋失調(diào)如何造成自身反應(yīng)性淋巴細胞克隆的病理性擴增，是一個重要的科學(xué)問題。多發(fā)性硬化癥（MS）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）作為自身免疫病“三大頑癥”，由于所具有的危害性和可能相似的免疫學(xué)發(fā)病機理已被列為我國關(guān)注的重大疾病。多發(fā)性硬化癥（MULTIPLESCLEROSIS，MS）嚴(yán)重累及患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CENTRALNERVOUSSYSTEM，CNS）。該病始發(fā)于2040歲的青壯年，在美國每年至少有350萬人患發(fā)MS，在我國，MS正以每年50萬人數(shù)的發(fā)病率遞增。該病會造成感覺缺陷如運動、自律和神經(jīng)認知功能的障礙而導(dǎo)致勞動力喪失，雖然MS通常不會明顯縮短患者的壽命，但該病對于社會經(jīng)濟所造成負擔(dān)，其影響僅次于對患者身體的傷害。作為一個復(fù)雜性狀的疾病，MS被認為是由環(huán)境因素和人類易感基因的相互作用而導(dǎo)致機體的免疫失衡。但其確切的發(fā)病機理仍“眾說紛紜”。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RHEUMATOIDARTHRITIS，RA）同屬一種病因未明的以侵犯四肢關(guān)節(jié)為主的常見自身免疫病。在我國乃至亞洲，RA的發(fā)病率高達04％1％，且具有高達15％的致殘率。目前正以每年400萬新增病例遞增。同其它自身免疫病一樣，長期以來仍限于用激素或非甾體類藥物姑息治療。雖然MS和RA的發(fā)病機理仍未完全明了，然而其免疫學(xué)介導(dǎo)的發(fā)病機制研究早已提示患者的遺傳背景、內(nèi)分泌因素、環(huán)境差異、細胞凋亡、尤以病毒感染與MSRA發(fā)病可能密切相關(guān)，再者自身反應(yīng)性T細胞以及其分泌的炎癥因子均是MS和RA患者發(fā)病的高危因素。近年來本論文作者所在的上海市免疫學(xué)研究所與瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科開展了MS的合作研究，特別是與上海市長寧區(qū)光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院合作，在國家自然科學(xué)基金、863項目、上海市科委重大和重點項目基金的資助下，率先建立了RA基礎(chǔ)和臨床合作研究梯隊及技術(shù)平臺，完善了一定規(guī)模的MSRA樣本庫，并從免疫遺傳學(xué)、細胞學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)多方面入手研究并取得了多項成果，相應(yīng)論文發(fā)表在2006年GENESIMMUNITY和2007年ARTHRITISRHEUMATISM等雜志上。然而，我們發(fā)現(xiàn)在前期經(jīng)T細胞疫苗干預(yù)治療的RA患者中仍有部分RA患者其ACR僅為20，且自身反應(yīng)性T細胞克隆并未隨著TCV療程而消失；因此揭示和闡明MS和RA真正的發(fā)病機制的本質(zhì)變得尤為重要。人們推測HHV6EBV可能是導(dǎo)致MS和RA發(fā)病的“罪魁禍?zhǔn)住?，其中可能的致病機理是基于病毒的“分子模擬”。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HHV6和MBP，EBVGP110與HLADRW4具有同源序列。當(dāng)病毒與MS的自身抗原MBP享有的共同肽段或抗原表位，EBVGP110與HLADRW4的MSRA患者體內(nèi)被誘導(dǎo)和激活的TB細胞經(jīng)胸腺陽性選擇隨即進入外周末梢，可能就在感染期通過某種機制穿過血腦屏障或穿行至關(guān)節(jié)腔，這些T細胞（被稱為自身反應(yīng)性T細胞）在識別具有“交叉反應(yīng)”的病毒肽段的同時也將表達于自身神經(jīng)髓鞘的MBP和具有HLADRW4表位的組織細胞視為“靶抗原”攻擊之，造成腦組織損傷和關(guān)節(jié)滑膜組織的損傷以至MS和RA的發(fā)生。然而盡管有很多證據(jù)說明病毒的“分子模擬”是一個較為合理的假說，可以用其來解釋MS和RA與HHV6EBV感染之間的關(guān)系，但作為MS和RA的真正發(fā)病機制還需要提供更多的免疫病理學(xué)實驗依據(jù)。因此本論文第一部分提出的科學(xué)問題是闡明HHV6病毒感染與多發(fā)性硬化癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。本論文的第二部分所要闡述的科學(xué)問題除了繼續(xù)闡明RA的免疫學(xué)發(fā)病機理并且首次嘗試應(yīng)用具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重功能的IFNΒ，在觀察其使用的安全性和可行性的同時，分析其具有的免疫調(diào)節(jié)功能。旨在為闡明MS特別是RA的發(fā)病機制，為臨床找到既有抗病毒作用又同時具有免疫調(diào)節(jié)和免疫重建的新療法提供前期工作和數(shù)據(jù)。

簡介：腸道病毒71型（ENTEROVIRUS71，EV71）是導(dǎo)致嬰幼兒感染的重要病原之一，可引起多種疾病，具有較廣的疾病譜。其中由EV71引起的兒童手足口?。℉，F(xiàn)OOT，MOUTHDISEASE，HFMD）最為常見，而且在嬰幼兒容易造成腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致死亡。EV71近年有多地區(qū)流行的趨勢。EV71在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組為正鏈單股RNA?；蚪M全長7500BP，編碼區(qū)僅有一個開放閱讀框（F），編碼約2200個氨基酸的多聚蛋白（POLYPROTEIN），該多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P3三個前體蛋白，P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3與VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，VP4位于病毒顆粒衣殼內(nèi)側(cè)與基因組RNA緊密連接，共同構(gòu)成EV71的抗原區(qū)。研究資料表明，雖然該病毒主要抗原決定區(qū)位于VP1，但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗體結(jié)合功能；已有的實驗結(jié)果顯示單獨的VP1和VP3免疫原性有限，若能獲得VP1～VP4，免疫原性將會得到明顯提高。鑒于此，我們首先對從流行區(qū)分離的EV71病毒進行了血清學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，采用RTPCR的方法克隆了P1和3CD基因，借助于載體PCDNA30BA構(gòu)建雙順反子穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP13CD和單基因的穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP1與PSHUTTLECMV3CD。經(jīng)同源重組獲得了重組腺病毒質(zhì)粒RADP13CD、RADP1、RAD3CD，分別轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝，獲得相應(yīng)的重組腺病毒RADP13CD、RADP1和RAD3CD，經(jīng)RTPCR檢測表明，三個重組腺病毒均已轉(zhuǎn)錄目的基因MRNA；免疫熒光和免疫組化檢測結(jié)果表明僅雙順反子重組腺病毒RADP13CD中可檢測到特異性目的蛋白，而RADP1、RAD3CD中未能檢測到特異性的表達產(chǎn)物，結(jié)果表明重組腺病毒可有效表達EV71P1和3CD基因，僅含P1或3CD基因的重組腺病毒表達產(chǎn)物未能被特異性抗體所識別，而含P1及3CD蛋白酶基因的雙順反子重組腺病毒表達產(chǎn)物具有EV71特異抗原性，提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重組腺病毒通過滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分別免疫BALBC小鼠，ELISA法檢測結(jié)果表明實驗組小鼠血清中均檢測到抗EV71特異性IGG的抗體，且由RADP13CD免疫后產(chǎn)生的抗體水平明顯高于RADP1和RAD3CD共免疫產(chǎn)生的抗體水平；三種不同的免疫方式結(jié)果證明，灌胃免疫方式最佳，滴鼻次之，皮下注射產(chǎn)生的抗體水平最低。目前有限次數(shù)的中和試驗還未能在實驗組血清中檢測到EV71特異性保護作用，其原因還有待進一步研究。本實驗成功克隆了包含EV71全部結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD，初步探索了EV71病毒蛋白之間的相互作用，為研究EV71結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)；為找尋最合理的相關(guān)重組腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索實驗，為EV71基因工程疫苗的研究做了前期的基礎(chǔ)工作。

簡介：目的了解河北省不同地區(qū)、不同人群中肝炎病毒的感染狀況和流行趨勢，掌握其流行特征，分析該省人群中肝炎病毒的感染相關(guān)因素，評價人群乙肝疫苗接種效果，為乙肝的科學(xué)防控提供基礎(chǔ)。方法2011年在河北地區(qū)常駐人口中開展血清流行病學(xué)研究，運用多階段整群系統(tǒng)隨機抽樣方法，隨機抽取22個縣區(qū)，按照系統(tǒng)抽樣法抽取縣區(qū)內(nèi)以家庭為單位的1～59歲居民，進行問卷調(diào)查，并同時靜脈采血5ML。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測血樣中乙肝病毒表面抗原HBSAG、乙肝病毒表面抗體抗HBS和乙肝病毒核心抗體抗HBC。利用EPIDATA310軟件對調(diào)查問卷及檢測結(jié)果進行雙錄入，運用EXCEL和EPIINFO軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。結(jié)果1本次調(diào)查全省11個市的22個縣（區(qū)），共抽樣5072人，有流行病學(xué)調(diào)查資料和有實驗室檢測結(jié)果的有效樣本4567人，應(yīng)答率為9004％。調(diào)查城市人口2311人，農(nóng)村人口2256人，分別占調(diào)查總?cè)丝诘?060％和4940％。男、女性別比為1∶106。2全省1～59歲人群HBSAG、抗HBS、抗HBC分別為331％、4335％、2967％。其中HBSAG陽性率最高的廊坊499％，最低的是唐山127％石家莊抗HBS陽性率最高，為56％。3城鄉(xiāng)人群HBSAG陽性率存在統(tǒng)計學(xué)差異，農(nóng)村高于城市城市人群抗BS陽性率高于農(nóng)村，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義農(nóng)村人群抗HBC陽性率高于城市，存在統(tǒng)計學(xué)差異。41～4歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時接種率分別為9405％、9405％，5～19歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時接種率分別為7090％、5543％。年齡愈大，乙肝疫苗全程接種率和首針及時接種率愈低。5將14個因素與乙肝HBSAG陽性的關(guān)系通過用LOGISTIC回歸模型進行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽性成員是影響乙肝感染的危險因素。結(jié)論1河北省人群HBSAG陽性率為331％，與1992年調(diào)查的HBSAG陽性率相比，HBSAG陽性率明顯下降。按照世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)，我省處于中流行區(qū)（8％＞HBSAG陽性率≥2％）。2河北省已經(jīng)實現(xiàn)2006～2010年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃全人群HBSAG陽性率將至7％以下的控制目標(biāo)。3河北省農(nóng)村地區(qū)HBSAG陽性率高于城市，15～29歲人群陽性率最高，以男性為主。4HBSAG陽性率與文化程度呈負相關(guān)不同民族HBSAG陽性率亦不相同。5乙肝疫苗接種已有大幅提高，低年齡組全程接種率及首針及時率農(nóng)村與城市已無差別。6通過用LOGISTIC回歸模型對調(diào)查的多種影響因素進行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽性成員是影響乙肝感染的危險因素。7人群抗HBS陽性率水平較1992年明顯上升，乙肝疫苗接種已取得顯著效果。

簡介：【背景】漢灘病毒HANTAANVIRUSHTNV在我國主要引起腎綜合征出血熱HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROMEHFRS該病危害極為嚴(yán)重目前尚缺乏特效的治療藥物主要使用疫苗進行預(yù)防。目前我國已成功研制HFRS滅活疫苗其推廣使用對預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題主要是不能有效刺激細胞免疫應(yīng)答誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱抗體滴度不高等因而研發(fā)新型的HFRS疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。近年來病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLEVLP疫苗由于其安全性好和免疫原性強的優(yōu)點使得其成為目前最有發(fā)展前景的新型基因工程候選疫苗之一。同時研究發(fā)現(xiàn)通過對VLP進行修飾將細胞因子錨定到VLP表面使其成為嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通過桿狀病毒表達載體系統(tǒng)BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTSYSTEMBEVS分別表達HTNV包膜糖蛋白GLYCOPROTEINGP和核衣殼蛋白NUCLEOCAPSIDPROTEINNP來構(gòu)建HTNVVLP同時表達糖基磷脂酰肌醇GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOLGPI錨定的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GRANULOCYTEMACROPHAGECOLONYSTIMULATINGFACTGMCSF或CD40配體CD40LIGCD40L使之修飾在VLP表面獲得了兩種HTNV嵌合VLPVLPGMCSFVLPCD40L并對其生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性進行了研究以期為進一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理論和實驗基礎(chǔ)?！痉椒ā繉TNV76118株編碼GP的M基因和編碼NP的S基因以及小鼠的GPIGMCSF以下簡稱GMCSF、CD40L基因分別克隆入BEVS中的PFASTBACTMDUAL轉(zhuǎn)移載體中構(gòu)建各重組桿狀病毒RECOMBINANTBACULOVIRUSRBV轉(zhuǎn)移載體PFASTBACTMDUALM、PFASTBACTMDUALS、PFASTBACTMDUALGMCSF、PFASTBACTMDUALCD40L酶切后瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定并進行序列測定。將構(gòu)建好的各RBV轉(zhuǎn)移載體分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌ESCHERICHIACOLIECOLIDH10BACTM后提取各RBV桿粒即BACM、BACS、BACGMCSF、BACCD40L并利用PCR進行鑒定。將構(gòu)建好的各RBV桿粒轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細胞后獲得各RBV分別命名為RBVM、RBVS、RBVGMCSF、RBVCD40L。取各RBV感染SF9昆蟲細胞利用間接免疫熒光法INDIRECTIMMUNOFLUESCENCEASSAYIFA檢測各目的蛋白的表達。將RBVM、RBVS以及RBVGMCSF或RBVCD40L通過共感染SF9昆蟲細胞的方式分別制備各組VLPVLP、VLPGMCSF、VLPCD40L在電鏡下觀察SF9昆蟲細胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中的各組VLP的組裝情況。分別大量制備和收集各組VLP通過蔗糖密度梯度離心法純化各組VLP并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗ENZYMELINKEDIMMUNOADSDENTASSAYELISA、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳SODIUMDODECYLSULFATEPOLYACRYLAEGELELECTROPHESISSDSPAGE、蛋白質(zhì)印跡法WESTERNBLOTWB、免疫共沉淀COIMMUNOPRECIPITATIONCOIP等方法進行鑒定。在上述工作的基礎(chǔ)上研究分析了各組VLP的生物學(xué)活性及免疫學(xué)特性。通過流式細胞術(shù)FLOWCYTOMETRYFCM分別檢測了各組VLP促小鼠骨髓細胞增殖能力、促小鼠骨髓細胞向樹突狀細胞DENDRITICCELLSDC分化能力以及促B淋巴細胞活化能力。將各組VLP通過皮下注射途徑免疫C57BL6小鼠以添加外源重組細胞因子的VLPVLPGMCSF、VLPCD40L、HFRS滅活疫苗以及PBS為對照。通過ELISA及微量細胞中和試驗分別檢測免疫后各組小鼠血清中抗HTNVGP及NP的特異性抗體及中和抗體的滴度以反映各組小鼠的體液免疫應(yīng)答的情況通過酶聯(lián)免疫斑點試驗ENZYMELINKEDIMMUNOSPOTASSAYELISPOT及細胞毒性T淋巴細胞CYTOTOXICTLYMPHOCYTECTL殺傷試驗分別檢測免疫后各組小鼠脾細胞分泌細胞因子的水平以及其CTL殺傷活性以反映各組小鼠的細胞免疫應(yīng)答的情況取HTNV76118株通過肌肉注射途徑接種各組免疫小鼠通過ELISA及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)QUANTITATIVEREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTIONQRTPCR分別檢測接種后各組免疫小鼠臟器組織中HTNV抗原及核酸通過蘇木精伊紅HEMATOXYLINEOSINHE染色各組小鼠臟器組織并進行鏡檢觀察接種后各組免疫小鼠臟器組織的病理學(xué)變化以評價各組VLP預(yù)防接種對HTNV感染的保護作用。【結(jié)果】將各目的片段克隆入BEVS轉(zhuǎn)移載體后酶切鑒定結(jié)果顯示各RBV轉(zhuǎn)移載體均切出與相應(yīng)目的基因大小相一致的核酸條帶測序結(jié)果顯示各目的基因序列正確無突變產(chǎn)生表明成功地構(gòu)建了各RBV轉(zhuǎn)移載體。對重組桿粒PCR鑒定結(jié)果顯示各RBV桿粒中均擴增出與預(yù)期大小相一致的核酸條帶證實各組RBV桿粒構(gòu)建正確。將各重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞獲得RBV感染細胞后IFA檢測結(jié)果顯示各組RBV均可表達相應(yīng)的目的蛋白。將各RBV共感染昆蟲細胞后電鏡觀察結(jié)果顯示在昆蟲細胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均可清楚地觀察到直徑大小約為80220NM的顆粒初步判定為各組VLP。大量制備各組VLP利用蔗糖密度梯度離心進行純化離心結(jié)束后能夠清晰的觀察到各組VLP的聚集帶。SDSPAGE及WB檢測各組VLP結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組VLP中均含有與相應(yīng)目的蛋白大小相一致的特異性蛋白條帶。ELISA及COIP檢測結(jié)果顯示在嵌合VLP中GMCSF或CD40L均成功地錨定在VLP上。對各VLP進行生物學(xué)活性檢測的結(jié)果顯示各組VLP均可刺激小鼠骨髓細胞的增殖和向DC的分化并有效地促進了小鼠B淋巴細胞的活化且VLPGMCSF的刺激能力要強于VLPCD40L和VLPP005。在HTNVGP或NP刺激下與PBS組相比各組VLP均可增強小鼠脾細胞的殺傷活性且隨著效靶比EFFECTCELLTARGETCELLET的升高而增強。VLPCD40L、VLPGMCSF組小鼠脾細胞殺傷活性在不同ET時均高于VLP組、滅活疫苗組以及相應(yīng)的外源細胞因子添加組其中VLPCD40L組殺傷活性最高P免疫小鼠保護實驗的結(jié)果顯示PBS對照組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織中的HTNV抗原檢測均為陽性而其他各實驗組以及正常對照組小鼠的所有臟器組織均未檢測到HTNV抗原。RTPCR檢測各組小鼠臟器中HTNV核酸的結(jié)果與病毒抗原結(jié)果結(jié)果相一致。HE染色鏡檢結(jié)果顯示PBS組小鼠的脾臟中出現(xiàn)了彌漫性出血淋巴細胞彌漫性浸潤以及白髓增多等病理學(xué)變化而其他各實驗組以及正常對照組小鼠的所有臟器組織均未觀察到病理學(xué)變化。上述結(jié)果提示HTNV能夠感染未經(jīng)免疫的C57BL6小鼠而經(jīng)各VLP免疫后能夠保護小鼠免受HTNV的攻擊?！窘Y(jié)論】本研究通過BEVS表達系統(tǒng)獲得了嵌合有GMCSF或CD40L的HTNVVLP各嵌合VLP均具有有良好的生物學(xué)活性同時嵌合在VLP表面的CD40L或GMCSF有效地增強了其刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力且各項指標(biāo)均優(yōu)于HFRS滅活疫苗組。免疫小鼠保護實驗結(jié)果證實嵌合VLP可以有效地保護C57BL6小鼠免受HTNV的攻擊。本研究為進一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定了良好的理論、實驗和物質(zhì)基礎(chǔ)。