乙肝病毒X蛋白HLA-A0201限制性CTL表位的篩選與免疫學(xué)鑒定.pdf

1、病毒性肝炎是我國(guó)的常見、多發(fā)病，其中乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因子之一。乙型肝炎病毒變異性高，其基因組包括四個(gè)開放閱讀框(C、P、S、X)，其中HBx編碼的蛋白是一種多功能性蛋白，為病毒基因組轉(zhuǎn)錄所必需，在乙型肝炎病毒的復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA修復(fù)及凋亡過程中起重要作用。因此，對(duì)HBx進(jìn)行深入研究具有極其重要的理論和臨床意義。 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答的核心成分，通過受體與帶有CTL表位即抗原肽

2、的MHC-I類分子互相作用，溶解、殺傷靶細(xì)胞?？乖氖强乖心鼙幻庖呒?xì)胞特異性識(shí)別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位，在機(jī)體免疫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，抗原表位的選擇也是能否獲得特異性抗體的關(guān)鍵。由于HBx表位可以被不同的MHC-I類分子所識(shí)別、遞呈，在這些MHC-I類分子中，中國(guó)人群中HLA-A2陽性的人群高達(dá)50％，因此對(duì)HLA-A0201限制性的CTL表位進(jìn)行研究具有更大的現(xiàn)實(shí)意義。 迄今為止，HBV

3、被分為八個(gè)不同的基因型(A-H)，以及眾多的血清型。我們選擇了中國(guó)人群中最常見B基因型中的adw血清型和C基因型中的adr血清型的基因序列作為研究對(duì)象，分別通過三個(gè)提供表位預(yù)測(cè)服務(wù)的網(wǎng)絡(luò)站點(diǎn)，以及超基序、延展基序和量化基序等方案預(yù)測(cè)獲得4條九肽作為候選表位 (HBx：VLCLRPVGA、HBx2：CLFKDWEEL、HBx3：VLHKRTLGL、HBx4：HLSLRGLPV)。由于預(yù)測(cè)結(jié)合并不等于實(shí)際結(jié)合，并且實(shí)際結(jié)合也并不意味著真正具

4、有免疫原性，所以有必要通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)表位的結(jié)合能力、免疫原性進(jìn)行進(jìn)一步的免疫學(xué)鑒定。為此，我們根據(jù)文獻(xiàn)分別選擇了陽性肽(HBc：FLPSDFFPSI)以及陰性肽(HBc，HLA-A2402：EYLVSFGVW)作為陽性、陰性參照。 T2細(xì)胞作為一種免疫學(xué)研究的工具，其表面空載的HLA-A0201分子表達(dá)極不穩(wěn)定，而外源性抗原肽的結(jié)合能夠提高HLA-A0201分子的穩(wěn)定性，因此我們通過T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和結(jié)合穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

5、各候選表位與HLA-A0201分子結(jié)合的親和力、穩(wěn)定性，四條候選表位中HBx2的親和力和穩(wěn)定性最高。 為了進(jìn)一步檢測(cè)各候選表位在體內(nèi)環(huán)境中的免疫原性，我們以HLA-A2.1/k<'b>轉(zhuǎn)基因鼠為模型，模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)四條候選表位刺激脾細(xì)胞釋放IFN-γ的能力和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細(xì)胞殺傷能力進(jìn)行了檢測(cè)，四條候選表位中HBx2同樣表現(xiàn)出較高的刺激脾細(xì)胞釋放IFN-γ和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細(xì)胞殺傷的能力。之后我們分離了HLA-A

6、0201陽性慢性活動(dòng)期乙肝病人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，通過檢測(cè)HBx2和各對(duì)照肽體外刺激單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ的能力和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細(xì)胞殺傷能力，對(duì)HBx2的免疫原性作進(jìn)一步的鑒定。根據(jù)體內(nèi)、體外鑒定的結(jié)果，我們利用HBx2構(gòu)建了可溶性的肽-四聚體，為將該表位進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷和治療鋪平了道路。 綜上所述，HBx2 (CLFKDWEEL)是一個(gè)潛在的HBx來源的HLA-A0201限制性CTL表位，具備應(yīng)用于臨床診斷、治