miR-129-5p在椎間盤退變中的作用及其表觀遺傳調(diào)控研究.pdf

1、椎間盤退變影響因素眾多,而其細胞外基質(zhì)的改變,尤其是Ⅱ型膠原的減少和Ⅰ型膠原的增加被認為是椎間盤退變的顯著特點之一。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)microRNA在椎間盤退變的機制中發(fā)揮著重要的作用,針對退變椎間盤組織的microRNA芯片檢測提示miR-129-5p在退變椎間盤髓核組織中出現(xiàn)異常下調(diào)。生物信息學(xué)方法預(yù)測COL1A1 mRNA(Ⅰ型膠原基因)和ITGA1 mRNA(整合素α1基因)為miR-129-5p的潛在靶基因。椎間盤退變時髓核

2、中Ⅰ型膠原增多的分子機制尚不明確,而整合素α1又是Ⅰ型膠原于髓核細胞上的受體。miR-129-5p作為同時調(diào)控配體(Ⅰ型膠原)和受體(整合素α1)的關(guān)鍵分子,在椎間盤退變進程中勢必發(fā)揮著重要的作用。本研究在明確了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1在退變及正常椎間盤髓核組織內(nèi)的表達分布差異后,分別通過體外實驗驗證 miR-129-5p對 COL1A1及ITGA1的直接調(diào)控作用,通過體內(nèi)調(diào)控miR-129-5p觀察其對退變模型病

3、理進程的影響;并且進一步驗證了 miR-129-5p可能的上游表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制。本研究以miR-129-5p作為中心環(huán)節(jié),構(gòu)筑了相對完整的椎間盤退變miR-129-5p調(diào)控機制,在椎間盤退變領(lǐng)域提出了全新的退變機制學(xué)說,并詳細闡明了其上下游調(diào)控機制。整個研究分為以下四個實驗:
　　實驗一人體髓核組織中miR-129-5p及COL1A1、ITGA1表達量的研究
　　背景及目的:我們前期microRNA芯片檢測提示miR-12

4、9-5p在退變椎間盤髓核組織中出現(xiàn)異常下調(diào)。生物信息學(xué)方法預(yù)測COL1A1 mRNA(Ⅰ型膠原基因)和ITGA1 mRNA(整合素α1基因)為miR-129-5p的潛在靶基因,Ⅰ型膠原的增加被認為是椎間盤退變的顯著特點之一,而整合素α1作為Ⅰ型膠原于髓核細胞上的受體,其在椎間盤退變進程中的作用尚無報道。要想探明上述三者在椎間盤退變進程中的作用,本部分實驗首先探索了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1 mRNA及其編碼的蛋白在退

5、變及正常椎間盤髓核組織的表達分布差異。
　　方法:收集正常尸體及退變患者的椎間盤髓核組織,用實時定量PCR方法檢測其miR-129-5p、COL1A1及ITGA1 mRNA的表達豐度差異,用天狼猩紅染色方法觀察其膠原的分布差異,用 HE染色方法觀察其病理學(xué)差異,用免疫熒光染色方法和westen blot方法觀察其Ⅰ型膠原及整合素α1表達和分布的差異,用熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標(biāo)方法觀察其miR-129-5p與Ⅰ型膠原及整合素α

6、1的共表達情況。
　　結(jié)果:天狼猩紅染色結(jié)果提示退變髓核組織Ⅱ型膠原被Ⅰ型膠原取代,椎間盤髓核組織中miR-129-5p下調(diào),同時ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白均出現(xiàn)上調(diào),熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標(biāo)結(jié)果提示miR-129-5p陽性細胞Ⅰ型膠原及整合素α1表達陰性,反之亦然。
　　結(jié)論:在髓核組織中,miR-129-5p的表達與ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白表達呈現(xiàn)負向調(diào)控趨勢。

7、　　實驗二 miR-129-5p對COL1A1、ITGA1表達調(diào)控的體外研究
　　背景及目的:通過實驗一我們發(fā)現(xiàn)了在髓核組織中,miR-129-5p的表達與ITGA1和COL1A1 mRNA及其編碼的蛋白表達呈現(xiàn)負向調(diào)控趨勢,然而在退變髓核組織中miR-129-5p和COL1A1及ITGA1的表達差異是由于兩者間的直接作用導(dǎo)致還是通過某些特定的中間信號通路導(dǎo)致呢?生物信息學(xué)方法預(yù)測,COL1A1及 ITGA1 mRNA的3’UTR

8、存在與miR-129-5p的潛在結(jié)合位點,這為我們研究miR-129-5p直接調(diào)控COL1A1及 ITGA1 mRNA提供了理論依據(jù)。本部分實驗旨在探索 miR-129-5p對COL1A1及ITGA1 mRNA的直接調(diào)控作用,及其對細胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法:通過雙熒光素酶報告基因方法檢測 miR-129-5p對 ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,用慢病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的髓核細胞,上調(diào)/下調(diào)其miR-12

9、9-5p的表達,用western blot方法檢測對COL1A1及ITGA1的表達影響;用實時定量PCR方法確認骨肉瘤細胞系MG-63及U-2 OS中有miR-129-5p的表達后,用慢病毒轉(zhuǎn)染MG-63及U-2 OS,上調(diào)/下調(diào)其miR-129-5p的表達用細胞劃痕實驗及Trans-well實驗檢測其對細胞功能學(xué)的影響。
　　結(jié)果:ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR是miR-129-5p的直接作用靶點,上調(diào)/下調(diào)miR

10、-129-5p的表達后,原代培養(yǎng)的髓核細胞中COL1A1及ITGA1的表達呈現(xiàn)出相應(yīng)的下調(diào)/上調(diào)改變。細胞劃痕實驗提示上調(diào)miR-129-5p表達組U-2 OS及MG-63細胞劃痕愈合速度明顯快于下調(diào)組。Trans-well實驗提示上調(diào)miR-129-5p表達組U-2 OS及 MG-63細胞遷移和侵襲能力明顯上升;下調(diào) miR-129-5p表達組 U-2 OS及MG-63細胞遷移和侵襲能力明顯下降。
　　結(jié)論:miR-129-5p

11、通過與其靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,影響靶蛋白CollagenⅠ和Integrinα1的表達,從而引起細胞功能學(xué)的改變。
　　實驗三 miR-129-5p對COL1A1、ITGA1表達調(diào)控的體內(nèi)研究
　　背景及目的:通過實驗一及實驗二我們確證了miR-129-5p對其靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA3’UTR的直接作用,然而體外培養(yǎng)的細胞成分簡單,條件可控性好,影響因素單一,與活體條

12、件下椎間盤組織的細胞微環(huán)境相差甚遠。本部分實驗旨在利用C57小鼠椎間盤退變模型,觀察體內(nèi)調(diào)控miR-129-5p對椎間盤退變病理進程的影響。
　　方法:用實時定量PCR方法確認C57小鼠體內(nèi)miR-129-5p的表達豐度后,用鼠尾穿刺法造成 C57小鼠椎間盤退變模型,分別于造模后通過腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染,上調(diào)或下調(diào)miR-129-5p在椎間盤的表達,通過western blot檢測轉(zhuǎn)染后3、6、12w個時間點小鼠椎間盤CollagenⅠ

13、及Integrinα1的表達變化,通過椎間隙高度指數(shù),組織學(xué)評分,熒光原位雜交-熒光免疫組化雙標(biāo)方法觀察各時間節(jié)點對小鼠椎間盤退變程度的差異。
　　結(jié)果:造模后3、6、12周,CollagenⅠ及Integrinα1的表達隨著時間持續(xù)上升,上調(diào)/下調(diào)miR-129-5p可以降低/增加各時間節(jié)點CollagenⅠ及Integrinα1的表達;上調(diào) miR-129-5p可以時間節(jié)點椎間隙高度指數(shù)及組織學(xué)評分明顯優(yōu)于下調(diào)miR-129-

14、5p組及陽性對照組。
　　結(jié)論:miR-129-5p在體內(nèi)試驗中表現(xiàn)出對椎間盤退變的保護作用,下調(diào)miR-129-5p可以使椎間盤退變程度增加。
　　實驗四 miR-129-5p表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制的研究
　　背景及目的:實驗一到實驗三通過了體外及體內(nèi)驗證,闡明了miR-129-5p對其下游靶基因靶蛋白的調(diào)控機制。然而其上游的調(diào)控機制尚不明確。本部分實驗旨在探索miR-129-5p上游的調(diào)控機制。
　　方法:取正常

15、對照組及退變組髓核組織各5例,針對miR-129-5p前體miR-129-1及miR-129-2啟動子10kb范圍內(nèi)存在的4個CpG島行甲基化DNA免疫共沉淀-實時定量 PCR(MeDIP-PCR)檢測,在體外培養(yǎng)的原代髓核細胞中,用 DNA甲基化抑制劑5-Aza-2’-deoxycytidine(5Aza-CdR)處理后通過qRT-PCR檢測其對miR-129-5p及其下游靶基因ITGA1和COL1A1 mRNA的表達調(diào)控作用。

16、>　　結(jié)果:定位于miR-129-2 chr11:43596990-43597336及chr11:43602545-43603215的的兩個CpG位點DNA甲基化程度在退變椎間盤中明顯上調(diào)(P<0.05),體外培養(yǎng)的原代髓核細胞經(jīng)過5Aza-CdR處理后 miR-129-5p表達上調(diào),ITGA1和COL1A1 mRNA表達下調(diào)。
　　結(jié)論:miR-129-5p在椎間盤退變進程中的異常下調(diào)與其前體pre-miR-129-2定位于ch