具ACC脫氨酶活性的堿蓬內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物的解鹽促生作用及其ACC脫氨酶基因的克隆.pdf

1、堿蓬(Suaeda salsa)是一種生長(zhǎng)于鹽堿地和海濱沙灘的耐鹽性極強(qiáng)的鹽生植物，在我國(guó)分布廣泛，是當(dāng)前生物改良鹽漬土的首選植物品種。大量研究證明，堿蓬的耐鹽能力主要源自耐鹽關(guān)鍵基因的表達(dá)或調(diào)節(jié)，而堿蓬內(nèi)生菌的多樣性及其對(duì)堿蓬的生長(zhǎng)及生理功能的影響卻長(zhǎng)期處于被忽視的地位。眾所周知，生物之間的共生是一種極為普遍的生命活動(dòng)和生態(tài)現(xiàn)象，大部分植物內(nèi)生菌都是植物物種進(jìn)化的結(jié)果，即內(nèi)生菌通過(guò)與宿主植物的相互作用，使植物能夠在特定環(huán)境下生長(zhǎng)、繁殖

2、。有研究表明，感染內(nèi)生真菌的植物具有較高的抗逆境脅迫的能力，而一些具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌在促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)及抗重金屬脅迫中也起到了作用，該酶是通過(guò)催化乙烯的關(guān)鍵中間前體物質(zhì)ACC轉(zhuǎn)化成α-丁酮酸來(lái)降低乙烯水平，從而緩解逆境脅迫產(chǎn)生的乙烯對(duì)植物造成的不良影響。
　　為深入探討處于高鹽環(huán)境中堿蓬內(nèi)生細(xì)菌的生態(tài)作用，本文從分離、篩選具ACC脫氨酶活性的堿蓬內(nèi)生細(xì)菌入手，對(duì)分離到的菌株測(cè)定其生物學(xué)特性

3、并進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)水平的鑒定，然后通過(guò)種子萌發(fā)試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)對(duì)菌株的解鹽促生效果作初步評(píng)價(jià)，最后對(duì)其ACC脫氨酶基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。具體結(jié)果如下:
　　1.從山東東營(yíng)健康堿蓬植株體內(nèi)分離篩選到具有較高ACC脫氨酶活力的內(nèi)生細(xì)菌LP11、SS12、TW1及TW2，4株菌還可不同程度地產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸、赤霉素和脫落酸，且均有溶磷作用，但無(wú)固氮能力及蛋白酶活力，唯有菌株SS12對(duì)蘿卜枯萎病菌(Fusarium

4、oxysporum f.sp.conglutinans)和黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)具有拮抗作用。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化、API鑒定系統(tǒng)和16S rRNA將其分別鑒定為棲稻假單胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)、成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。

5、　　2.通過(guò)種子萌發(fā)試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)研究了不同NaCl濃度脅迫下菌株LP11對(duì)不同植物的解鹽促生作用。結(jié)果表明，菌株LP11不僅能促進(jìn)宿主堿蓬種子的萌發(fā)，還有助于非鹽生植物黃瓜及油菜種子的萌發(fā)，且經(jīng)LP11菌懸液處理的種子的芽長(zhǎng)與未接菌的處理相比均有一定程度的增加；LP11還可顯著促進(jìn)不同鹽濃度條件下黃瓜與玉米植株的生長(zhǎng)，其根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、株高及鮮重與相應(yīng)對(duì)照比較亦有一定程度的增加；除此之外，LP11能夠促進(jìn)黃瓜和玉米植株合成葉綠素、可溶性糖

6、及脯氨酸，從而增強(qiáng)植物的抗逆能力。
　　3.本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株LP11的ACC脫氨酶基因進(jìn)行了克隆，可為今后將ACC脫氨酶基因轉(zhuǎn)化植物、從而增強(qiáng)植物的抗逆性奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用CODEHOP法擴(kuò)增菌株LP11 ACC脫氨酶基因的保守序列，再通過(guò)染色體步移法獲得該基因已知區(qū)域5’及3’端的非保守的未知區(qū)域，最后根據(jù)拼接的序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得acdS基因的完整編碼區(qū)。測(cè)序結(jié)果顯示，該片段長(zhǎng)996 bp，通過(guò)Blast搜索及系統(tǒng)發(fā)育分析