斑馬魚(yú)p8、p8-L1和p8-L2基因的時(shí)空表達(dá)及其在脅迫反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)外界脅迫的反應(yīng)中起著重要的作用。螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子是動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子最大的家族之一。p8,又稱(chēng)com1或Nupr1,是在結(jié)構(gòu)上具有bHLH基序的轉(zhuǎn)錄因子。近年來(lái),該基因在哺乳動(dòng)物應(yīng)急反應(yīng)中的作用引起了很大的關(guān)注,但其在魚(yú)類(lèi)脅迫反應(yīng)中作用還知之甚少。魚(yú)類(lèi)的生活環(huán)境變化較大,在脅迫條件下,易引起自身免疫力的低下,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)。本論文擬以模式魚(yú)類(lèi)生物-斑馬魚(yú)為研究對(duì)象,對(duì)p8及同樣屬于p8超家族

2、的p8-L1(p8-like1)和p8-L2(p8-like2)基因進(jìn)行克隆,闡明這些基因的組織分布及在胚胎發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律；在此基礎(chǔ)上研究這些基因?qū)Ω鞣N脅迫因子的響應(yīng),并進(jìn)一步嘗試研究它們參與脅迫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制,勢(shì)必會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的健康養(yǎng)殖具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 斑馬魚(yú)p8 cDNA全長(zhǎng)730 bp,位于3號(hào)染色體,最大開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)含有75個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),理論分子量約8.961KDa,等電點(diǎn)為8.433。斑馬魚(yú)p8蛋

3、白在39-65和60-74氨基酸殘基處分別有bHLH和NLS的保守序列。斑馬魚(yú)p8基因組含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,3個(gè)外顯子大小分別是225bp、138bp和353bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,斑馬魚(yú)p8與脊椎動(dòng)物的p8親緣關(guān)系較近。p8-L1和p8-L2 cDNA全長(zhǎng)分別是742bp和813bp,均位于5號(hào)染色體,具有相同的ORF,編碼一個(gè)含有76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),理論分子量均約為8.801KDa,等電點(diǎn)均為8.86。但二者的基因組結(jié)構(gòu)

4、不同,斑馬魚(yú)p8-L1基因組含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,3個(gè)外顯子大小分別是291bp、208bp和147bp,而p8-L2基因組只含有1個(gè)外顯子,大小是813bp。和p8一樣,二者均具有Phospho_p8 domain。
　　 Quantitive real-time PCR方法檢測(cè)三基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示,斑馬魚(yú)p8mRNA在被檢測(cè)的各組織和不同的發(fā)育時(shí)期均廣泛表達(dá)。其中在脊柱中表達(dá)最高,在肝臟、腦組織中表達(dá)較強(qiáng),在

5、鰓、腸、肌肉中表達(dá)較弱；斑馬魚(yú)p8的mRNA在胚胎發(fā)育的各時(shí)期差異很大,在卵裂期,母源性的轉(zhuǎn)錄物較高存在,隨后表達(dá)量持續(xù)降低,到體節(jié)期最低,而在孵化期的表達(dá)又急劇升高。這些結(jié)果表明,斑馬魚(yú)p8是作為一種管家基因在各組織中廣泛表達(dá),且可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。斑馬魚(yú)p8-L1的組織表達(dá)與p8差異較大,而斑馬魚(yú)p8-L2與p8較為相近；三者在胚胎各時(shí)期的表達(dá)模式基本相同,但在孵化期后兩者表達(dá)升高不明顯。另外,胚胎整體原位雜交與Quant

6、itive real-time PCR分析結(jié)果基本一致,研究顯示,斑馬魚(yú)p8基因廣泛表達(dá)于整個(gè)卵裂球中,一直持續(xù)到原腸胚期；到了體節(jié)形成期,在頭部區(qū)域和脊索腹面?zhèn)葏^(qū)域表達(dá)較強(qiáng),背面?zhèn)葏^(qū)域幾乎不表達(dá),隨著體節(jié)的形成逐漸完全,整體表達(dá)較弱,頭部區(qū)域表達(dá)較強(qiáng),軀干及尾部區(qū)域信號(hào)較弱；到了孵化期,整體表達(dá)更弱。斑馬魚(yú)p8-L1和p8-L2的表達(dá)也均與p8相類(lèi)似。這些結(jié)果提示,斑馬魚(yú)p8、p8-L1和p8-L2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及眼、心臟、血管

7、和內(nèi)臟等各組織、器官的早期分化中均發(fā)揮重要作用。
　　 用多種環(huán)境脅迫因子(饑餓、溫度、滲透壓、pH值)處理成體斑馬魚(yú),Quantitive real-time PCR方法檢測(cè)斑馬魚(yú)p8、p8-L1及p8-L2基因的對(duì)不同環(huán)境脅迫的響應(yīng)。結(jié)果顯示,斑馬魚(yú)p8在受到饑餓、溫度、滲透壓、pH值等不同環(huán)境因子脅迫后,其表達(dá)都明顯上調(diào),證明斑馬魚(yú)p8是一個(gè)應(yīng)激相關(guān)分子,參與了廣泛的脅迫反應(yīng)。斑馬魚(yú)p8-L1及p8-L2基因受到脅迫后(滲